摘要：将丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-α与肿瘤靶向肽NGR融合,制备luffin-α-NGR重组蛋白,并检测其对肿瘤细胞与血管生成的抑制活性。通过引物设计及PCR扩增获得luffin-α-NGR融合基因,与pGEX-6p-1载体连接后获得pGEX-6p-1/luffin-α-NGR重组质粒,质粒转入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21中表达,以GST亲和层析法分离纯化目的蛋白。MTT比色法、Transwell迁移实验以及鸡胚尿囊膜实验(CAM)检测其活性。结果表明,成功获得全长为849bp的luffin-α-NGR融合基因,目标蛋白在16℃、0.5mmol/LIPTG诱导16h后获得最佳表达,经SDS-PAGE和Western blotting分析,GST融合蛋白分子量为56.6 kDa,与预期一致。重组蛋白经GST亲和层析、蛋白酶精准酶切去除标签后,利用MTT法验证其对HepG2和MDA-MB-231细胞的抑制效果显著优于luffin-α。Transwell迁移实验和CAM实验证实重组蛋白luffin-α-NGR对肿瘤细胞迁移和血管生成具有明显的抑制作用。本研究成功地制备了重组蛋白luffin-α-NGR,并证实该重组蛋白对肿瘤细胞具有良好的抑制活性,为后续重组靶向蛋白药物的开发奠定基础。

摘要：目的优化同时提取甘草中皂苷和总黄酮的工艺条件。方法在单因素试验的基础上,氨浓度(A)、乙醇浓度(B)、回流时间(C)、液料比(D)为自变量,选用响应面法中的中心组合设计(CCD)进行4因素5水平试验,采用紫外分光光度法进行测定,以甘草中皂苷和总黄酮含量作为检测指标,检测波长分别为252 nm和510 nm。运用R语言环境下的熵权法对上述2指标进行权重赋值,建立3层结构的BP神经网络模型,对不同隐层神经元(size)的个数进行模型的测试训练,最后采用R语言的实数编码程序,建立并优化遗传算法数学模型,对提取工艺进行目标寻优,最终得到最佳提取工艺。结果皂苷和总黄酮分别在质量浓度0.008~0.056 g/L和0.024~0.080 g/L与吸光度具有良好的线性关系,方法学考察符合测定要求。选取隐层神经元个数为5的神经网络模型,优化遗传算法的各项参数后对甘草中皂苷和总黄酮进行提取工艺的目标优化,最终得到的最佳提取条件为:氨浓度0.62%,乙醇浓度64%,回流时间1.8 h,液固比12∶1。模型综合评价预测值为191.65,而按照上述最佳提取条件试验所得的平均综合评价值为188.90,两者相对误差为1.43%,证明神经网络和遗传算法具有较好的预测性。结论建立的数学模型寻求同时提取甘草皂苷和总黄酮最佳提取条件是科学可行的,为实现中药化学成分乃至药效物质基础多目标寻优提供了新的参考和思路。

摘要：目的得到青蒿素超声提取最优工艺。方法利用响应面法优化青蒿素提取工艺。基于单因素实验,选取超声时间、超声功率和料液比进行三因素三水平的试验设计,以青蒿素提取率为响应值进行响应面分析。结果青蒿素的最佳提取工艺为超声时间42 min,超声功率82 W,料液比4.2 g/50mL,此条件下提取率为0.688%。预测值与验证试验结果一致。结论基于该响应面模型分析优化青蒿素提取工艺的方法有效可行。

摘要：目的:基于标准离差法和最小二乘支持向量机(LS-SVM)数学模型优化丹参中丹酚酸B和丹参酮ⅡA两种有效成分的提取工艺。方法:在单因素试验基础上,超声温度、超声时间、液料比和乙醇浓度作为丹酚酸B和丹参酮ⅡA提取率的影响因素,选用Box-Benhnken Design中心组合试验设计进行四因素三水平试验,采用HPLC测定丹酚酸B和丹参酮ⅡA含量并计算各自提取率。运用标准离差法对丹酚酸B和丹参酮ⅡA的提取率进行权重赋值,得到综合值作为评价指标。最后建立LS-SVM模型对综合评价值和对应的提取工艺条件进行寻优和预测。结果:LS-SVM模型得到的最佳提取工艺为:超声温度85℃、超声时间52 min、液料比12∶1(mL/g)、乙醇浓度90%,在此条件下得到的最优综合评价值为15.32,验证试验的平均真实值为15.34,两者相对误差为0.13%。结论:将标准离差法和LS-SVM应用于丹参中丹酚酸B和丹参酮ⅡA提取工艺的优化和预测,验证试验结果吻合最优预测值,说明该模型可靠。此模型为中药有效成分的提取工艺优化研究提供了一种新的思路与参考。

摘要：目的:建立一套基于DNA遗传标记技术的红曲菌株快速鉴定方法。方法:采用RAPD方法对分离收集的10个红曲菌株进行多态性分析,从菌株F中获得1个421 bp的特异RAPD标记片段F421。Blast分析未发现F421序列(GenBank登录号EF063107)与GenBank中相关序列有较高同源性。根据该序列设计特意引物,对10个红曲菌株进行PCR检测。结果:利用所获得的特征性片段扩增区域(SCAR)标记能能在1 d内准确地鉴别出红曲F菌株。结论:利用SCAR分子标记技术对红曲菌株进行分类鉴别是红曲研究领域的新尝试,为推广应用SCAR分子标记技术对药用真菌进行菌株快速准确鉴定提供技术依据。

摘要：目的了解大肠埃希菌临床菌株超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因及其携带模式、β-内酰胺类抗生素诱导以及组氨酸激酶抑制剂抑制细菌蛋白磷酸化和ESBLs基因表达的作用机制。方法采用PCR和测序法确定大肠埃希菌主要ESBLs基因（KPC、TEM、SHV、CTX-M）及其携带模式。采用E-test和微量试管稀释法分别测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。采用固定化金属螯合层析法、细菌蛋白磷酸化检测试剂盒及实时荧光定量RT-PCR分别检测1／4MIC青霉素和头孢噻肟诱导或组氨酸激酶抑制剂（氯氰碘柳胺、自行设计的溴化或碘化甲基咪唑）抑制大肠埃希菌耐药菌株蛋白磷酸化和ESBLs基因mRNA水平升高的作用。结果183株β-内酰胺类抗生素耐药大肠埃希菌临床菌株中，TEM和CTX-M基因检出率（83．1％和77．1％）高于其他基因且以两者同时携带模式为主（65．0％）（P〈0．05）。1／4MIC青霉素和头孢噻肟钠能诱导大肠埃希菌耐药菌株蛋白磷酸化及TEM、SHV、CTX—M基因mRNA水平显著升高（P〈0．05）。200μmol氯氰碘柳胺、2或10μmol溴化甲基咪唑、20或50μmol碘化甲基咪唑无抑制或杀灭大肠埃希菌的作用，但能抑制上述抗生素诱导的细菌蛋白磷酸化和ESBLs基因mRNA水平升高（P〈0．05），也能提高大肠埃希菌耐药菌株对青霉素和头孢噻肟的敏感性（P〈0．05）。结论TEM和CTX—M是本地区β-内酰胺类抗生素耐药大肠埃希菌临床菌株优势ESBLs基因，TEM＋CTX-M是ESBLs基因优势携带模式。亚致死量β内酰胺类抗生素可经TCSS上调大肠埃希菌ESBLs基因表达水平，但可被组氨酸激酶抑制剂所抑制。

摘要：根据GenBank登录的蒜氨酸酶序列(S73324)设计上下游引物,利用RT-PCR技术从浙江大蒜鳞茎中扩增蒜氨酸酶基因,获得了长度为1523bp的cDNA序列,提交GenBank(登录号:FJ786257,命名为浙江蒜氨酸酶)。利用生物信息学相关软件对该序列进行同源性比较、进化分析、蛋白质的结构和酶活性中心预测,引用pPICZaC载体构建蒜氨酸酶毕赤酵母真核表达重组质粒。结果表明:浙江蒜氨酸酶与其他葱属植物如大蒜、洋葱、冬葱、火葱和细香葱蒜氨酸酶具有高度同源性,进化关系比较接近,目的基因可以成功构建到毕赤酵母表达载体。浙江蒜氨酸酶三维结构呈树枝状,蛋白质分子的N端含有一个类似表皮生长因子结构域,酶的中心含一个天冬氨酸氨基转移酶超家族结构域;蛋白质结构中Lys-277可能是磷酸吡哆醛的结合位点,Lys-277周围区域可能是酶活性中心部位。重组质粒经鉴定构建正确。

摘要：目的:比较胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的差异。方法:RFPCR产物测序检测胶质瘤细胞和正常胶质细胞中GluR2 Q/R位点的A-to-I编辑水平。根据前期研究鉴定出的选择性剪接位点设计特异性引物,RT-PCR方法检测胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中不同剪接转录本的相对表达量,比较胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2 mRNA前体剪接模式的差异。结果:胶质瘤细胞中GluR2 Q/R位点的A-to-I编辑水平明显下降。RT-PCR检测到在胶质瘤细胞中,Exon 1a(+)/1a(-)、Exon 2(+)/2(-)的比值在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中无显著性差异。Exon 5a(+)/5a(-)的比值明显高于正常星形胶质细胞HA1800。结论:Exon 5a位点的剪接在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中有显著性差异,Exon 5a(+)转录本的表达增加可能是导致胶质瘤细胞中ADAR2编辑活性下降的原因。

摘要：目的:探讨Bcl-x mRNA前体剪接转换寡核苷酸(Bcl-x splice-switching oligonucleotides,Bcl-x SSO)对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法:设计靶向Bcl-x基因下游选择性5'端剪接位点的Bcl-x SSO,β-globin SSO作为阴性对照SSO。SSO经2'-甲氧乙基(2'-O-methoxyethyl,MOE)、全硫代磷酸化(phosphorothioate,PS)修饰。采用阳离子脂质体将不同的SSO转染至U251细胞。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测Bcl-x SSO对U251细胞的增殖抑制率。流式细胞术定量检测U251细胞的凋亡率。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Bcl-x SSO对Bcl-xL、Bcl-xS mRNA表达水平的影响,Western blot方法检测Bcl-x SSO对Bcl-xL、Bcl-xS蛋白表达的影响。结果:MTT结果显示Bcl-x SSO显著抑制U251细胞的增殖,且抑制作用呈剂量依赖性。流式细胞术检测Bcl-x SSO能够明显促进U251细胞凋亡。RT-PCR检测Bcl-x SSO处理组Bcl-xL mRNA表达水平下降,Bcl-xS mRNA表达水平升高。Western blot检测Bcl-x SSO处理组Bcl-xL蛋白表达水平下降,Bcl-xS蛋白表达水平升高。结论:在胶质瘤细胞U251中,Bcl-x SSO可特异性的作用于Bcl-x mRNA前体,调节其选择性剪接模式从Bcl-xL转换至Bcl-xS,进而促进U251细胞凋亡。

摘要：目的:设计获得5段hIL-18异构体,定向插入pEGFP-C1质粒形成融合基因,转染胰腺癌Bx-PC-3细胞并表达,为进一步研究改建的hIL-18蛋白功能奠定实验基础。方法:设计引物从pGEM-T-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入pEGFP-C1载体构建不同的突变子(Mu0、Mu1、Mu2、Mu3和Mu4),转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平。结果:(1)五种重组质粒经酶切与测序证实构建成功;(2)BxPC-3细胞转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)成功构建了hIL-18五种异构体的绿色荧光蛋白表达载体;(2)改建的hIL-18蛋白可与绿色荧光蛋白在BxPC-3细胞融合表达。