摘要：本研究以372只60周龄麻黄鸡的DNA为模版,通过设计引物,Sanger测序,以及位点分析,发现ALKBH5基因的第五外显子中存在6个SNPs位点,且均表现出不同程度的多态性。其中g.1112T>N发生四等位基因突变,g.984A>g、g.1033A>g、g.1112T>N、g.1194T>C位点与300日龄母本产蛋性能显著相关,g.1112T>N和g.1194T>C与390日龄母本产蛋性能显著相关。因此ALKBH5基因的6个SNP位点,可作为辅助选择优质繁殖性能蛋鸡的标记,为提高家禽产蛋性能和品种改良提供理论依据。

摘要：蟾蜍皮肤基源的中药材（如蟾皮和蟾酥）,已长期应用于临床,主要治疗炎症、疼痛以及多种肿瘤。为分析这些蟾蜍中药材中含有的多肽类有效成分,通过菌落DNA聚合酶链式反应（colony polymerase chain reaction）对日本蟾蜍（Bufo japonicus formosus）皮肤cDNA质粒文库进行筛选,克隆到958 bp的转录子（GenBank accession number：KF769458）,包括5＇端13 bp、3＇端498 bp的非翻译区和447 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码由148个氨基酸残基组成的蛋白质,与人及其他动物的内皮分化相关因子-1（endothelial differentiation-related factor-1,EDF-1）显示高度同源性。为分析中华大蟾蜍（***）皮肤中是否存在EDF-1的表达,在日本蟾蜍cDNA序列的基础上设计引物,并以中华大蟾蜍皮肤第一链cDNA为模板,通过PCR克隆中华大蟾蜍EDF-1 ORF。测序分析表明其ORF为447 bp（GenBank accession number：KF769459）,与日本蟾蜍的ORF长度相同,两者编码的蛋白之间存在3个氨基酸的差异,但与人源EDF-1的相似性均为95%,与其他动物的相似性介于93%-97%,表明其在进化上的高度保守性。磷酸化位点预测显示9个潜在的磷酸化位点,与已报道的该蛋白的生物学活性受上游因子的调控的研究结果相吻合。由于哺乳动物的EDF-1参与抑制内皮细胞的分化,因此它很可能是蟾蜍皮肤基源的中药材中含有的抗肿瘤的有效成分之一。

摘要：猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2),是感染猪Sus scrofa domestica的一种单链DNA病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法,对于PCV2感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计了荧光定量聚合酶链式反应(PCR)引物,利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法。结果表明:该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,每微升的最低检测限低至101拷贝DNA。利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测,检测符合率为100%,明显高于普通PCR方法的50.0%。因此,本研究建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法为该疾病的预防和控制提供一种有效的检测工具。

摘要：旨在克隆猪ADAM10基因及其剪接体的编码区(Coding sequence,CDS),利用生物信息学方法分析其序列结构和生物学功能,并揭示ADAM10基因及其剪接体mRNA在猪组织中的表达特征。根据GenBank中公布的猪ADAM10基因的序列信息,设计特异性引物,运用反转录PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCR)方法结合T/A克隆技术进行ADAM10基因及其剪接体编码区的克隆,利用生物信息学方法分析ADAM10及其剪接体蛋白的结构,同时用半定量PCR(Semi-quantitative PCR)分析猪ADAM10基因完整型及其剪接体mRNA在猪不同组织中的表达谱。结果显示,克隆和测序获得两种ADAM10CDS序列,其中完整型CDS长2 247bp,编码748个氨基酸;剪接型CDS缺失外显子2~7和部分外显子8,其长度为1 344bp,编码447个氨基酸。和完整型蛋白相比,猪ADAM10剪接体编码的蛋白不存在前引导序列,但存在完整的信号肽序列和跨膜结构域,并含有金属蛋白酶域和解聚素结构域,其三级结构也和完整型一致。序列比对和进化树分析表明,猪ADAM10完整型蛋白在物种间具有较高的保守性。半定量PCR分析表明,ADAM10基因完整型mRNA在脾中表达量较高,在肾、乳腺、腿肌、输卵管、卵巢、子宫、小肠等组织中低水平表达;ADAM10基因剪接体mRNA在肺中表达量较高,在脾和胃中也有低水平表达。本研究为进一步探究猪ADAM10基因的结构和生物学功能提供了基础资料。

摘要：猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)给养猪业造成了重大的经济损失,建立经济、快速的检测方法尤为重要。本研究旨在利用巢式PCR技术,建立高灵敏度PCV2检测平台,以加强对猪圆环病毒病的防控。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计内、外2对巢式PCR引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式PCR检测方法,并对猪场临床样本进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法灵敏度高、重复性强,最低检出量为10拷贝/μL,检出率达97.3%。本研究建立的巢式PCR检测方法为快速、高效地检测PCV2以及为猪圆环病毒病的防控提供有力手段。

摘要：单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰染色阳性菌,在人类与动物生活环境中均广泛分布,为人畜共患病原菌。李斯特菌溶血素O(LLO,由hly编码)作为李斯特菌重要毒力因子主要在细菌裂解并逃逸吞噬体中起作用,但其潜在的分子机制尚待深入解析。以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,通过PCR分别扩增hly基因的上、下游同源臂序列(各约500bp),选用SOE PCR方法将同源臂整合连接成融合片段。经BamHⅠ/SalⅠ酶切、连接后克隆至李斯特菌温敏型穿梭质粒pKSV7中得到重组质粒pSL081,测序验证后电转至EGD-e感受态细胞中,在温度变化及抗生素双重选择压力下筛选获得hly基因缺失株Δhly。同时,设计引物扩增含hly基因启动子和编码区序列的片段,克隆至李斯特菌整合型质粒pIMK2中得到重组质粒pSL251,测序验证后电转至缺失株Δhly感受态细胞中,经抗性筛选获得回补株CΔhly。测序结果显示,缺失株Δhly和回补株CΔhly均构建正确。利用Western blot方法检测突变株中LLO的表达情况,结果显示EGD-e和CΔhly中均能检测到LLO的正常表达,而Δhly中无法检测到,进一步证实成功构建了hly基因缺失株和回补株,为下一步深入探索LLO在李斯特菌感染过程中的生物学功能奠定了基础。

摘要：本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列(登录号:XM_001927795.6)设计引物,PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列,使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构,并进行同源性比对及系统进化树构建,利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示,猪GRP78基因CDS区长1 965bp,可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明,GRP78理论分子质量为72.3ku,等电点(pI)为5.06,半衰期为30h,其水溶液在280nm处的消光系数为30 495,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为32.39,属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40,总平均疏水指数为-0.496,无跨膜结构,存在信号肽序列,说明该蛋白属于分泌型蛋白;GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域:HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示,GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示,猪GRP78基因与人(登录号:NM_005347.4)、小鼠(登录号:NM_001163434.1)、大鼠(登录号:NM_013083.2)、山羊(登录号:XM_005687138.3)、牛(登录号:NM_001075148.1)核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%,氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%,各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示,GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达,在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。

摘要：犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬科烈性传染病,给患病动物带来重大危害。本研究基于犬瘟热病毒的NP蛋白基因设计特异性引物,利用RT-PCR获得287bp目的片段,经TA克隆并测序。结果表明,该片段与NCBI上公布的犬瘟热病毒NP序列(登录号:EU716322)同源性达到98%。利用该特异性的RT-PCR方法,检测杭州市及周边部分地区犬瘟热的流行情况,结果表明,整个杭州及周边地区犬瘟热病毒总阳性检出率为6.7%,杭州城区阳性个体数最多,阳性率最高达到18.8%,其他地方(临安、台州、舟山)阳性率较低。该研究为犬瘟热的综合防制提供基础数据。

摘要：试验旨在对猪SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease 1,SENP1)基因CDS区进行克隆和生物信息学分析,并探讨SENP1基因在乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染PK15细胞后的表达情况。根据GenBank中公布的猪SENP1基因预测序列(登录号:XM_013997974.2)设计特异性引物,通过RT-PCR和T/A克隆技术对猪SENP1基因CDS区序列进行克隆测序,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR分析猪SENP1基因在JEV感染PK15细胞不同时间点(0、12、24、36、48 h)的表达情况。结果显示,猪SENP1基因CDS序列全长2034 bp,共编码677个氨基酸。序列比对和系统进化树分析结果表明,猪SENP1蛋白序列和山羊、犬、人、牛的相似性分别为94.8%、94.2%、93.9%和93.8%,说明在这些物种中SENP1的保守性较强;猪与犬的SENP1分子亲缘关系较近。生物信息学分析结果显示,猪SENP1蛋白相对分子质量为76825.76,等电点为8.53,体外半衰期为30 h,不稳定系数为53.59,总平均亲水指数为-0.622。SENP1蛋白不含信号肽序列,无跨膜结构域。二级结构分析结果显示,SENP1蛋白中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占31.31%、46.68%、16.25%和5.76%。三级结构分析结果显示,猪SENP1蛋白中存在8个α-螺旋区和7个β-转角区。实时荧光定量PCR结果显示,猪SENP1基因在JEV感染的PK15细胞中呈现上调表达趋势,其中在感染后48 h SENP1基因表达量显著高于对照组(P<0.05)。本试验结果为后续深入研究SENP1基因功能提供了参考。

摘要：试验旨在研究日粮中添加竹叶黄酮提取物(BLFE)和雪莲果提取物(SSRE)对萧山鸡母鸡的生产性能、蛋品质、血清生化以及肠道菌群的影响。采用2×2双因素完全随机试验设计,主因子分别为BLFE(0%、0.75‰BLFE)和SSRE(0%、2.4%SSRE)。选取28周龄萧山鸡母鸡720只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复30只鸡,各组分别饲喂基础日粮(对照组)、基础日粮+0.75‰BLFE(BLFE组)、基础日粮+2.4%SSRE(SSRE组)以及基础日粮+0.75‰BLFE+2.4%SSRE(复合组)。预试期14 d,试验期63 d。结果表明:与对照组相比,BLFE组、SSRE组以及复合组母鸡的平均日采食量均提高(P<0.05),且SSRE组母鸡平均日采食量高于BLFE组和复合组;BLFE组、SSRE组以及复合组对鲜蛋品质及蛋壳品质均无显著影响;与对照组相比,BLFE组鸡蛋保存7 d后水分散失率降低(P<0.05);SSRE组母鸡血清中乳酸脱氢酶(LDH)水平降低(P<0.05);与对照组相比,BLFE组、SSRE组以及复合组母鸡肠道中双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度均提高(P<0.05),且SSRE组双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度高于BLFE组和复合组(P<0.05);BLFE组以及复合组巨单胞菌属(Megamonas)相对丰度有提高趋势(0.05<P<0.1);SSRE组提高了肠道中放线菌门(Actinobacteriota)相对丰度,降低肠球菌属(Enterococcus)相对丰度(P<0.05)。可见,日粮中添加0.75‰BLFE、2.4%SSRE或两者复合均可提高母鸡平均日采食量、改善肠道菌群,其中2.4%SSRE的综合效果相对更好。