摘要：目的建立快速检测结核分枝杆菌异烟肼（INH）和利福平（RFP）耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变的多重聚合酶链反应-单链构象多态性（multi PCR-single strand conformational polymorphism analysis，mPCR-SSCP）方法。方法药敏试验检测134株结核分枝杆菌临床菌株对INH和RFP的耐药性。设计结核分枝杆菌INH和RFP耐药相关katG、inhA和rpoB基因PCR引物，建立mPCR-SSCP技术检测上述菌株katG、inhA和rpoB基因的突变，同时采用PCR直接测序技术（PCR—DS）检测上述基因片段突变情况，并对上述3种方法检测结果进行分析和比较。结果134株临床菌株均含有katG、inhA和rpoB基因，其中42株（31．3％）对INH耐药、45株（33．6％）对RFP耐药。mPCR-SSCP和PCR-DS检测结果显示，92株INH敏感菌株katG和inhA基因均未发生突变，检测特异性均为100％；89株RFP敏感菌株中rpoB基因分别有2株和1株检测出突变，检测特异性分别为97．8％和98．9％；42株INH耐药菌株中分别有33株和36株katG和／或inhA基因突变，检测灵敏度分别为78．6％和85．7％；45株RFP耐药菌株中rpoB基因分别有41株和43株发生突变，检测灵敏度分别为91．1％和95．6％。结论本研究建立的mPCR-SSCP能快速、简便、特异，并有一定的敏感性检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药相关基因katG、inhA和rpoB突变，具有临床应用前景。

摘要：目的了解大肠埃希菌临床菌株超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因及其携带模式、β-内酰胺类抗生素诱导以及组氨酸激酶抑制剂抑制细菌蛋白磷酸化和ESBLs基因表达的作用机制。方法采用PCR和测序法确定大肠埃希菌主要ESBLs基因（KPC、TEM、SHV、CTX-M）及其携带模式。采用E-test和微量试管稀释法分别测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。采用固定化金属螯合层析法、细菌蛋白磷酸化检测试剂盒及实时荧光定量RT-PCR分别检测1／4MIC青霉素和头孢噻肟诱导或组氨酸激酶抑制剂（氯氰碘柳胺、自行设计的溴化或碘化甲基咪唑）抑制大肠埃希菌耐药菌株蛋白磷酸化和ESBLs基因mRNA水平升高的作用。结果183株β-内酰胺类抗生素耐药大肠埃希菌临床菌株中，TEM和CTX-M基因检出率（83．1％和77．1％）高于其他基因且以两者同时携带模式为主（65．0％）（P〈0．05）。1／4MIC青霉素和头孢噻肟钠能诱导大肠埃希菌耐药菌株蛋白磷酸化及TEM、SHV、CTX—M基因mRNA水平显著升高（P〈0．05）。200μmol氯氰碘柳胺、2或10μmol溴化甲基咪唑、20或50μmol碘化甲基咪唑无抑制或杀灭大肠埃希菌的作用，但能抑制上述抗生素诱导的细菌蛋白磷酸化和ESBLs基因mRNA水平升高（P〈0．05），也能提高大肠埃希菌耐药菌株对青霉素和头孢噻肟的敏感性（P〈0．05）。结论TEM和CTX—M是本地区β-内酰胺类抗生素耐药大肠埃希菌临床菌株优势ESBLs基因，TEM＋CTX-M是ESBLs基因优势携带模式。亚致死量β内酰胺类抗生素可经TCSS上调大肠埃希菌ESBLs基因表达水平，但可被组氨酸激酶抑制剂所抑制。

摘要：目的建立基于溶细胞毒素基因vvhA检测创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的TaqMan实时荧光定量PCR。方法采用Primer Express软件，设计位于vvhA基因序列保守区的PCR引物和TaqMan探针，建立检测创伤弧菌vvhA基因100bp扩增产物的TaqMan实时荧光定量PCR。采用基因克隆技术，构建作为阳性对照的pMD19-vvhA100重组质粒。以最低扩增循环数（Ct值）、荧光强度增加值（△Rn）为观察指标，对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR条件进行优化。以不同浓度的创伤弧菌及其它8种细菌DNA和pMD19-vvhA100为模板，对vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR的特异性、敏感性和重复性进行验证。创伤弧菌经腹腔和皮下注射及灌胃感染ICR小鼠，验证vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR对感染小鼠血液、皮下感染组织和肠内容物的检测效果。结果所建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA或pMD19-vvhA100呈现阳性检测结果，其检测灵敏度可达0．01ng创伤弧菌DNA或10^3个拷贝的pMD19-vvhA100，不同浓度pMD19-vvhA100三次检测结果的SD≤0．79，对腹腔和皮下感染创伤弧菌的小鼠血液、皮下组织标本检测结果均为阳性。结论所建立的创伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR具有快速、稳定、敏感、特异等优点，适合用于临床实验室进行创伤弧菌引起的败血症和创口感染快速诊断。

摘要：目的通过比较环介导的等温扩增技术（loop—mediatedisothermalamplification，LAMP）与实时荧光PCR（***）技术在检测问号钩端螺旋体的特异性及灵敏度方面的差异，寻找一种快速、灵敏且特异性强的问号钩端螺旋体检测方法。方法根据问号钩端螺旋体liplAl基因序列设计LAMP及实时荧光PCR扩增所用的特异性引物，对我国15群15株问号钩端螺旋体参考菌株进行检测，比较二者在检测的特异性和灵敏度方面的差异。结果LAMP反应大约可在30min内完成，整个分析过程不超过1h。Real-timePCR的整个过程大约需要60min。二者具有相同的检测灵敏度和特异性，最低检出限度均为100个拷贝，整个检测过程没有出现假阳性。结论在检测速度、灵敏度和特异性方面，LAMP技术与real—timePCR技术相当，但LAMP检测技术是在恒温条件下进行，不需要特别昂贵的仪器设备，检测方法简单，在基层实验室及现场检测方面具有明显的优势，是可应用于问号钩端螺旋体检测的一种有效技术。

摘要：目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)fliR基因的致病性。方法:分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因。构建fliR基因自杀质粒,并设计和合成特异性siRNA。采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA的基因沉默技术构建问号钩体fliR基因突变株,并用PCR、测序、半定量RT-PCR进行鉴定。采用小鼠单核-巨噬细胞J774A.1黏附试验和流式细胞术,检测敲除fliR基因的问号钩体突变株56601fliR-Kana、siRNA阻断fliR基因的问号钩体突变株56601siRNA-R2株黏附细胞,及诱导细胞坏死或凋亡能力的变化。结果:所克隆的fliR基因与GenBank中相应基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%和100%,所克隆的kana基因核苷酸序列与pET42a图谱完全相同。56601fliR-Kana可在含氨苄青霉素和卡那霉素的EMJH培养基中生长,PCR和测序结果证实56601fliR-Kana株fliR基因中插入了kana基因。56601fliR-Kana株fliR基因mRNA水平明显下降(P<0.01),56601siRNA-R2株fliR基因mRNA水平也低于野生株(P<0.05)。56601fliR-Kana和56601siRNA-R2黏附J774A.1细胞的能力基本消失,诱导J774A.1细胞坏死或凋亡的能力也明显减弱(P<0.01)。结论:fliR基因是问号钩体毒力相关基因,其功能与问号钩体黏附细胞、诱导细胞凋亡或坏死密切相关。

摘要：为了提高医学微生物学实验教学质量,激发学生学习兴趣,掌握基本实验操作技能并同时提高应用能力及培养科研思维,对本校2011级5年制临床医学专业学生的医学微生物学实验教学进行了一定的改革和探索。采用病例讨论式教学,综合性实验设计等方法,将病原生物学、免疫学实验教学内容整合,教学效果评价为期末考试结合调查问卷的方式。通过改革使学生成为教学过程的主体,充分激发了学生的学习热情,不仅培养了学生的动手能力,更提高了他们交流和合作、综合分析和解决问题的能力。