摘要：目的建立对人疱疹病毒6型（HHV-6）能同时进行定量和分型的荧光定量PCR检测新方法，运用该方法对临床疑似病毒性脑炎患儿进行检测。方法以HHV-6聚合酶基因区（U38）为靶序列，设计通用引物和特异性分型探针，建立能同时检测HHV-6型A／B亚型的荧光定量PCR方法，进行敏感性和特异性实验。对临床445例疑似脑炎患儿的脑脊液标本进行HHV-6荧光定量分型检测，阳性结果测序验证。结果HHV-6A和HHV-6B病毒株荧光定量分型检测结果均为阳性，两亚型之间无交叉。单纯疱疹病毒1型和2型、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-马尔病毒、乙肝病毒、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、人类基因组DNA及空白对照均为阴性。HHV-6荧光定量分型最低能检测到10拷贝／μl HHV-6A／B。在临床445例疑似脑炎患儿脑脊液标本中检出HHV-6阳性21例（4．72％），其中HHV-6A阳性4例，HHV-6B阳性16例，HHV-6A和HHV-6B混合感染1例。整个PCR操作过程2—3h。结论HHV-6荧光定量分型方法能对HHV-6同时进行定量和分型，具有特异、敏感、简便、快速的特点，可为临床HHV-6感染性脑炎提供早期、敏感的诊断依据。

摘要：目的探讨新生儿败血症的快速可靠诊断方法,以提高临床检测细菌的速度及准确性。方法以细菌16S rRNA 基因为靶序列,设计通用引物及 TaqMan 探针,建立细菌16S rRNA 基因实时荧光定量 PCR 反应体系;选择临床引起新生儿败血症的常见菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠埃希菌等进行浓度梯度实验;对临床疑为新生儿败血症的830例感染性疾病的新生儿抽取静脉血分别做细菌16S rRNA 基因荧光定量 PCR 和血培养检测。结果临床常见分离株金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌荧光定量 PCR 检测结果均为阳性;巨细胞病毒、EB 病毒、乙肝病毒,新型隐球菌及白色念珠菌,人基因组 DNA 及空白对照均为阴性。细菌荧光定量 PCR 最低能检测到3个细菌,其荧光定量 CT 值为37.90;对临床疑为感染性疾病的830例患儿标本中,荧光定量 PCR 检测血标本阳性率5.18%(43/830),血培养阳性率2.41%(20/830),前者明显高于后者,差异具有统计学意义,P<0.01,30例非感染性疾病患儿血标本荧光定量 PCR 检测及细菌培养均为阴性。若以血培养作为对照,荧光定量 PCR 方法的诊断敏感性为100%,特异性为97.16%,正确诊断指数为0.972。结论建立了细菌16S rRNA 基因荧光定量 PCR 诊断新生儿败血症方法。其检测快速、简便,为新生儿败血症提供早期、敏感的病原学诊断依据。

摘要：目的建立载体法筛选人巨细胞病毒（HCMV）截短UL54基因（UL54S）小干扰RNA（siRNA）靶位的体系。方法利用质粒pAVU6±27设计并构建2个小发夹RNA（shRNA）表达载体（psiUL54-1和psiUL54-2），与融合蛋白表达载体pUL54S-绿色荧光蛋白（EGFP）共转染AD293细胞，荧光显微镜观察融合蛋白荧光表达，RT-PCR法分析UL54SmRNA水平变化，流式细胞仪评价siRNA对融合蛋白的抑制作用，采用方差分析对流式细胞检测结果进行统计分析，筛选出有效的siRNA作用靶位。结果shRNA表达载体psiUL54—2与融合蛋白表达载体pUL54S-EGFP共转染AD293细胞48h后，pUL54S-EGFP、psiUL54-2共转染组EGFP表达量较pUL54S-EGFP、pAVU6±27共转染组下降；凝胶分析显示，psiUL54—2与pUL54S-EGFP共转染48h后，UL54S mRNA相对表达量为19．6，明显低于pUL54S-EGFP、psiUL54—1共转染组的96．6与对照组的100．0；psiUL54—1、pUL54S—EGFP共转染48h后对融合蛋白UL54S-EGFP表达无影响（P〉0．05），但psiUL54—2、pUL54S-EGFP共转染抑制融合蛋白UL54S—EGFP的表达（19．43×10^4±2．29×10^4比27．89×10^4±5．50×10^4，P＜O．01）。结论成功建立载体法筛选HCMV截短UL54S siRNA靶位体系，UL54S序列中1532～1550位点是有效的siRNA靶位点。

摘要：目的　建立 1种能快速区分 4种疱疹类病毒DNA的特异性酶切图谱。方法　在疱疹类病毒高度同源序列DNA多聚酶基因中设计 1对通用引物 ,该引物能同时扩增单纯疱疹病毒Ⅰ型与Ⅱ型 (HSVI/Ⅱ )、爱泼斯坦 巴尔病毒 (EBV)、人巨细胞病毒 (CMV) 4种病毒。选择BamHI和BstUI 2种内切酶对同一PCR产物进行酶切 ,建立了能区分 4种疱疹类病毒的PCR限制性内切酶片段长度多态性分析 (RFLP)法。采用PCR RFLP和ELISA法 ,对 75例怀疑病毒感染的患儿和 38名健康儿童的血标本进行上述 4种病毒DNA及IgM抗体检测。结果　 4种标准病毒株PCR扩增后产物为 5 10～ 5 92bp ,经酶切后能区分病毒种类 ,其最小检出量为 0 1fg ,与乙型肝炎病毒、新型隐球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和人类基因组DNA无交叉反应。用该方法检测临床 75份血标本 ,阳性 2 3份 ,其中CMV、EBV和HSVⅡ感染分别为 13、4和 5例 ,HSVI为 1例 ,同时用ELISA法检测该标本 ,10例阳性 ,分别为CMV5例、EBV3例和HSVⅡ 2例。在 38例健康体检儿童的血标本中上述 4种病毒DNA及IgM抗体均为阴性。结论　本研究建立的 4种疱疹类病毒特异性酶切图谱具有特异敏感 ,快速准确的特点 ,能检测到ELISA法不能检测到的疱疹病毒感染。

摘要：目的　探讨新生儿败血症的快速诊断方法。方法　 (1)以 16SrRNA基因为靶序列 ,设计引物及寡核苷酸探针 ;将探针固定在特制的玻片上制作成基因芯片 ;(2 )对临床疑为细菌感染的 2 85例新生儿抽取静脉血分别做血培养和细菌 16SrRNA基因检测 :于血标本及脑脊液中抽提DNA后采用聚合酶链反应 (PCR)扩增 ,将扩增产物加样在基因芯片上杂交后进行激光扫描及读片。结果(1)PCR检测阳性率 5 96 % (17/2 85 )明显高于血培养的 2 81% (8/2 85 ) ,差异有显著意义 (P <0 0 1)。若以确诊败血症作为对照 ,PCR的诊断敏感性为 10 0 % ,特异性为 96 75 % ,正确诊断指数为 0 96 8。(2 )对 17份PCR阳性标本进一步做基因芯片杂交 ,结果通用探针均阳性 ,其中G+ 探针阳性 12份、G-探针阳性 5份 ;8份PCR和血培养均阳性的标本 ,基因芯片杂交探针阳性菌株与血培养细菌阳性结果完全一致。结论　基因芯片杂交技术检测临床标本中 16SrRNA基因能快速诊断新生儿败血症 ,除较血培养等方法有更好的敏感性和特异性外 ,还能快速明确系何种病原菌感染 。

摘要：目的细菌培养、组织学、免疫学及普通PCR方法等在病原菌的检测方面都存在一定的不足,不能满足临床的需要,探索快速可靠的败血症和化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病诊断的新方法是目前亟待解决的关键问题。方法分析细菌16S rRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和探针,以及革兰阳性和阴性分型探针,对12种标准菌株、23种临床培养分离株、乙型肝炎病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA等进行了荧光定量检测,分析三种探针检测结果的相关性。结果细菌16S rRNA基因荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,最低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因,即相当于2个细菌,与病毒、真菌及人基因组DNA等无交叉阳性反应;12种标准菌株、23种临床培养分离株均进行三种探针的荧光定量检测:通用探针均为阳性,18株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针(G+Probe探针)检测为阳性,17株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针(G-Probe探针)检测为阳性,反之均为阴性,吻合率100%。结论建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌荧光定量PCR定量、分型方法。其检测方便,快速、敏感性和特异性高,符合率好,同时进行定量和分型,在病原菌检测方面具有推广及应用价值。

摘要：目的建立16S rRNA基因加基因芯片检测新生儿败血症的诊断技术,以提高临床检测细菌的速度及准确性。方法对125例拟诊为败血症的新生儿血标本及部分脑脊液标本进行细菌16S rRNA基因及基因芯片检测,包括DNA提取、设计引物和探针、聚合酶链反应(PCR)扩增、基因芯片的制备、杂交、激光扫描与读片。结果125例中PCR检测血标本阳性64例,占51.2%;血培养阳性32例,占25.6%;非特异性指标41例,占32.8%,差异有统计学意义(P<0.01)。若以血培养阳性和/或非特异指标至少两项阳性为诊断标准,PCR灵敏度为90.3%(56/62),特异度为87.3%(55/63),正确诊断指数为0.776。3例脑脊液标本中PCR阳性2例,培养阳性仅1例。对64例PCR阳性血标本进一步作基因芯片检测,结果通用探针均阳性。其中G+探针阳性60份,G-探针阳性4份。30份PCR和血培养均阳性的标本中其探针菌株与血培养细菌阳性结果相符。2例脑脊液标本PCR阳性,基因芯片检测结果与培养结果相符。结论16S rRNA基因PCR加基因芯片杂交可为新生儿败血症提供早期、敏感的病原学诊断依据。

摘要：目的建立一种快速分型检测临床常见的7种疱疹病毒的新方法。方法以7种人疱疹病毒的DNA多聚酶基因区为靶序列,设计多重引物及寡核苷酸分型探针,点样制成基因芯片。用所建基因芯片检测282份疑似病毒感染患儿血标本,以荧光定量PCR法作对照,评价该芯片的诊断价值。结果基因芯片法最低检出浓度为10拷贝/μl,HBV、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌及人基因组DNA等无杂交信号。282份血标本共检出阳性59份,以荧光定量PCR法检测结果为标准,其敏感性为96.7%,特异性为99.5%,Youden指数为0.962;两法总符合率98.9%。结论研制的基因芯片可同时检测7种人疱疹病毒,且特异敏感、快速简便,有临床应用价值。

摘要：目的建立细菌革兰阴、阳性菌双重实时荧光定量检测体系，探讨其检测败血症的临床应用价值。方法分析细菌16SrRNA基因序列，在高度保守区自行设计通用引物和革兰阴性和阳性分型探针，选取临床较常见的35株菌株进行细菌革兰双检实时荧光定量PCR方法检测；对临床疑为败血症的512例新生患儿分别做细菌革兰双检荧光定量PCR和血培养检测。结果细菌革兰双检荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性，能稳定检测到10CFU左右细菌数。35株菌株进行细菌革兰双检荧光定量PCR检测，均为阳性，且革兰阴、阳性菌能正确分型和定量。巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA及空白对照均为阴性。对临床疑为败血症的512份新生患儿标本中，革兰双检荧光定量PCR检测血标本阳性率8．20％（42／512），血培养阳性率6．25％（32／512），前者明显高于后者，差异具有统计学意义（χ^2=8．10，P〈0．01），30例非感染性疾病同期患儿血标本革兰双检荧光定量PCR及细菌培养均为阴性。若以血培养作为对照，细菌革兰双检荧光定量PCR方法的诊断敏感度为100％，特异度为97．92％，准确性98．05％。结论建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌革兰双检荧光定量PCR方法。其检测快速、准确，具有很大的临床推广价值。