摘要：应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)进行基因编辑,为疾病模型的建立、致病机制研究、药物筛选及基因校正治疗疾病提供了更广阔的平台。相对于CRISPR-Cas9介导的基因敲除,应用该系统介导的同源重组实现基因点突变或突变校正效率要低、且难度偏大。为了实现对MYO7A杂合点突变(c.4118C>T)的人i PSCs的点突变校正,本文构建了表达maxGFP的pX330质粒。针对需校正的突变位点,设计5组识别序列并连接到maxGFP-pX330中构建靶向质粒。将5组打靶质粒分别转染HEK 293FT细胞48 h,细胞表达GFP;测序结果显示,MYO7A基因相应位点出现杂峰,表明打靶质粒具有打断活性。将同源模版单链寡核苷酸链(single-stranded DNA oligonucleotides,ss ODN)与打靶质粒共同电转入人i PSCs后48 h,经流式分选出(5. 8±2. 2)%的细胞表达GFP。分选后细胞行单克隆扩增并测序。结果显示,打靶质粒1和ss ODN组合对点突变校正未成功;打靶质粒2、3、4、5与ss ODN组合均获得了校正后的细胞株。本研究表明,打断位点是影响同源重组校正效率的关键因素。当应用CRISPR/Cas9(或其它核酸酶)介导的同源重组进行基因编辑操作时,可以同时选择多个打靶位点造成基因组不同位置上的双链打断(double-stranded break,DSB)位点,以获得目的单克隆细胞株。本研究为应用CRISPR-Cas9系统对人诱导多能干细胞进行基因编辑提供了有力参考。