摘要：目的利用小干扰RNA(siRNA)抑制骨肉瘤及正常成纤维细胞中cyclin A2基因的表达,并观察其对细胞生物活性的影响。方法设计并化学合成3对针对cyclin A2基因的siRNA,用Oligofectamine分别将其转染到骨肉瘤细胞系MG-63及正常人成纤维细胞HSF中,以无义siRNA转染作为阴性对照;以real-time PCR、Western blot检测cyclin A2基因沉默效果,采用MTT、RT-PCR、流式细胞、克隆培养等方法评价抑制cyclin A2基因表达后细胞的生长状态,同时检测PCNA及cyclin B1表达的改变。结果3对siRNA均能使cyclin A2 mRNA的表达降低,其中siRNA,抑制率最高。在骨肉瘤细胞MG-63中,转染50 nmol/L的siRNA,48 h后,cyclin A2的mRNA及蛋白表达被抑制近80%,这导致细胞增殖抑制,80.1%的细胞被阻滞在G0/G1期,克隆形成能力下降至45.5%,同时,PCNA及cyclin B1的mRNA表达明显降低。对正常成纤维细胞HSF,虽然siRNA1能抑制近60%的cyclin A2 mRNA及蛋白表达,但细胞的增殖及克隆形成能力未受影响。结论针对cyclin A2基因的siRNA能有效降低细胞中cyclin A2 mRNA及蛋白的表达,抑制骨肉瘤细胞的生长,而对正常细胞影响不大。表明cyclin A2是骨肉瘤细胞增殖所依赖的关键基因,抑制其表达有望成为治疗骨肉瘤的新途径。

摘要：背景与目的:我们在结肠癌组织中发现了一个新的基因HERV-H-X。本研究的目的是分析HERV-H-Xenv区的缺失情况,研究其与其他HERV-Henv开放阅读框(open reading frames,ORF)的表达关系以及其在结肠癌与正常组织中的表达差异情况。方法:对HERV-H-X与含完整的envORF的HERV-H/env62、HERV-H/env60以及HERV-H/env59进行多序列比对,分析HERV-H-Xenv区的缺失情况。对HERV-H-X设计特异的引物,对HERV-H/env62、env60以及env59的envORF设计共同的引物,分别在8对结肠癌与相应癌旁正常组织中进行RT-PCR,比较它们的表达情况。对HERV-H-X进行实时荧光定量PCR,研究其在17对结肠癌与相应正常组织中的表达水平。结果:HERV-H-Xenv区缺失的序列正好相应于HERV-H/env62、env60以及env59的envORF区。RT-PCR结果显示HERV-H-X特异地在结肠的癌组织中表达,而HERV-Henv的ORF在结肠的癌组织与正常组织中都有表达。定量PCR结果显示HERV-H-X在结肠癌组织的平均表达水平是相应正常组织的24.9倍,经F检验证实差异有统计学意义(P<0.01)。结论:HERV-H-X的表达与结肠癌特异相关,但由于缺失env的ORF,其在结肠癌的高表达与env基因无关。

摘要：为了研究特异小干扰RNA(siRNA)作用于大肠癌细胞株SW 480中PLK1(Polo-like k inase 1)基因表达的mRNA对该细胞分裂生长的影响,设计了对应于PLK1基因表达mRNA不同位点的10种特异siRNA,经化学合成后,用脂质体转染SW 480细胞,实时定量PCR检测PLK1基因的表达,观察不同的siRNA作用强度,并计数细胞了解相应细胞的生长情况,W estern-b lot观察PLK1表达蛋白的变化和流式细胞计数分析细胞周期改变。发现10种siRNA均可敲除PLK1基因表达的20%以上,其中P1、P4和P9 3组敲除mRNA达80%以上,这3种siRNA及其混合物对PLK1基因mRNA的作用具有相应浓度效应,在25 nmol/L时达到最佳作用效果,而且相同浓度的混合物作用效果更好(超过95%),PLK1表达蛋白质明显降低,细胞周期在G2期受到阻碍。72 h后的各种siRNA浓度下细胞生长变化与PLK1基因的mRNA水平变化相一致。结果表明化学合成的特异siRNA对SW 480细胞中PLK1基因表达具有消除作用,混合物作用更强,在细胞水平上抑制了SW 480细胞的分裂生长。

摘要：目的　建立并验证大肠癌序贯筛检方案在我国人群中应用的效果。方法　以大肠癌高发区嘉善县 1989年 30岁及以上者作为目标人群 ,采用随机分组空白对照研究设计 ,以免疫法粪便潜血试验结合个体危险度隶属度函数 (AD值 )为初筛手段 ,纤维肠镜为复筛的序贯筛检方案。结果经筛检后筛检人群与对照人群的大肠癌 8年累积发病率分别为 3.95‰ (95 %CI为 3.81～ 4.10 )和4.0 1‰ (95 %CI为 3 .86～ 4.16 ) ,两者差异无显著性 ;而大肠癌的累积死亡率则分别为 2 .0 8‰ (95 %CI为 1.96～ 2 .18)和 2 .44‰ (95 %CI为 2 .33～ 2 .5 5 ) ,筛检人群较对照人群约下降了 15 %左右。其中直肠癌累积死亡率下降达 31% ,经生存分析筛检区直肠癌的生存率显著高于对照区 (log rank =9.0 1,P =0 .0 0 2 7)。结论　粪便潜血试验和个体危险度AD值的序贯筛检方案在人群中实施 。

摘要：目的　探索急性髓系白血病 (AML)逆转录病毒病因的可能性。方法　运用已获得的逆转录病毒 6 # 11克隆为探针和引物 ,通过Northernblot和RT PCR技术检测AML患者白血病细胞中相关逆转录病毒基因的表达情况。结果　以 6 # 11为探针 ,Northernblot杂交的阳性条带在 9.4kb和 4.5kb左右 ,19例AML患者白血病细胞中 18例出现了阳性条带 ;RT PCR设计的引物扩增片段长度为 790bp ,14例AML患者白血病细胞中阳性表达 11例。结论　AML患者白血病细胞中相关逆转录病毒基因呈特异性表达。

摘要：Cullin-RING E3泛素连接酶(CRL)是泛素-蛋白酶体系统的重要组分,参与催化蛋白质的泛素化,促进随后的蛋白质降解,从而影响细胞周期、细胞凋亡、DNA复制、信号转导等多种细胞生理活动,且在多种肿瘤细胞中异常活化。以MLN4924为代表的拟素化抑制剂的成功研发有力地证实了CRL是可行的抗肿瘤靶点,具有很好的药物研发潜力。近年来,不断有新的研究通过高通量筛选、基于计算机辅助的虚拟筛选或基于结构的药物设计技术寻找特异的CRL抑制剂,但由于CRL复合物具有多种亚单位,呈蛋白-蛋白相互作用和多变的蛋白构象,缺乏典型的小分子药物结合位点等特性,其相关药物研发仍面临巨大挑战。截至目前,CRL小分子抑制剂主要以研究最为透彻的SCF泛素连接酶复合体的底物识别亚基F-box蛋白家族为靶点。此外,也发现数个通过靶向UBE2M-DCN1相互作用,特异性阻断CRL3/CRL1拟素化,从而抑制CRL3/CRL1泛素连接酶活性的小分子化合物。另一方面,也有CRL激动剂的报道,主要见于植物生长素吲哚乙酸和免疫调节性酰亚胺类药物。此外,靶蛋白水解嵌合体(PROTAC)是一项靶向蛋白-蛋白相互作用的新技术,其通过特异性小分子抑制剂链接一个CRL E3泛素连接酶来精确降解特定促癌靶蛋白,已成为近年来利用E3泛素连接酶设计抗肿瘤靶向药物的热点。

摘要：小分子干扰RNA(siRNA)能够在哺乳动物细胞中引起包括病毒基因在内的基因沉默。为了研究多种siRNA联合应用在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制中的效果,本研究设计了12种针对不同HBV靶点的siRNA,转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG22.2.15细胞,并采用了酶联免疫法检测上清液中HBsAg和HBeAg的含量,实时定量PCR法检测细胞中HBV的DNA含量。结果发现这12种分子均能在不同程度上抑制病毒复制。进一步研究表明它们对HBV的抑制作用在一定程度上存在剂量效应和协同作用,单分子siRNA在80nmol/L处对HBsAg和HBeAg的抑制率分别可达到约80%和60%,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对HBsAg就能达到90%的抑制率,但对HBeAg表达的抑制率提高不明显。单分子siRNA在80nmol/L处对HBVDNA复制的抑制率可达到90%以上,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对DNA含量就能达到约90%的抑制率。本研究的结果为进一步开发新的联合应用多种siRNA治疗HBV的途径打下了基础。

摘要：目的探讨小干预RNA(siRNA)对稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)6bE6基因的细胞株中靶基因的干预作用。方法建立并筛选稳定表达靶基因HPV6bE6的阳性细胞株,分别设计同源于HPV6bE6基因的不同序列的4对siRNA,采用实时定量PCR技术检测siRNA转染前后细胞内靶mRNA的表达情况。结果转染细胞中HPV6bE6基因表达最低有90%以上被抑制,低浓度siRNA水平(1nmol/L^150nmol/L)即能有效抑制靶基因表达,靶mRNA的沉默于转染siRNA后24h达到最强,且至少可维持4d。结论siRNA-HPV6bE6可以高效、特异地沉默HPV6bE6基因,可能为治疗HPV6b型感染提供实验室依据。

摘要：近几年，一些学者对传统的快速大量液体复苏观念提出了质疑，同时也提出 了在失血性休克早期进行限制性液复苏的概念。笔者采用Capone等设计的一种有活动性出血的SD大鼠失血性休克模型，比较无液体复苏、限制性液体复苏和快速大量液体复苏对大鼠失血性休克的救治疗效。

摘要：目的探讨polo-like kinase-1(PLK1)基因对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。方法根据PLK1基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子(small interfering RNA,si RNA),转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和TRAP-ELISA方法检测PLK1基因转染对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。结果所设计的5个si RNA均能明显抑制大肠癌SW480细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好。以P4转染处理大肠癌细胞后,PLK1 mRNA水平和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。MTT和TRAP-ELISA方法检测发现,P4si RNA转染组细胞增殖和端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,P<0.05)。结论PLK1基因对大肠癌细胞增殖具有重要的调控作用;以PLK1 si RNA转染处理大肠癌细胞,可明显抑制大肠癌细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关。