摘要：利用模式植物拟南芥AtPex16p/SSE1基因序列与油菜数据库BBSRC BrassicaDB比对,得到甘蓝型油菜(Brassica napus)同源EST序列,拼接出油菜Pex16p基因全长cDNA电子克隆,然后设计全长引物,以甘蓝型油菜种子cDNA为模板,克隆Pex16p基因,得到全长为1 101bp的cDNA,编码366个氨基酸的蛋白,命名为BnPex16p。Bn-Pex16p基因序列与拟南芥AtPex16p/SSE1同源,其蛋白与拟南芥同源蛋白具有完全相同的PTS2型过氧化物酶体定位肽,进化关系相近。半定量PCR(RT-PCR)发现BnPex16p基因在油菜幼嫩的根、茎、叶和种子中均有高丰度表达,在种子发育过程的中期和后期表达水平增加,暗示该基因在油脂的积累中有重要作用。

摘要：绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pF-GC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR。注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达。

摘要：磷酸烯醇式丙酮酸/磷酸转运子基因(Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator1,PPT1)是细胞质体碳水化合物转运的一个关键基因,在植物莽草酸代谢和脂肪酸生物合成途径中起着重要作用。根据十字花科拟南芥PEP转运子AtPPT1基因序列与油菜数据库BBSRC Brassica DB中相应ESTs设计全长引物,以甘蓝型油菜(Brassica napus)幼嫩叶片基因组DNA和种子cDNA为模板,克隆到了甘蓝型油菜PEP转运子基因全长序列,命名为BnPPT1。该基因基因组gDNA全长为2 075 bp,含有8个内含子,编码区长度为1 224 bp,编码407个氨基酸。序列比对结果表明,BnPPT1与同属于十字花科拟南芥AtPPT1转运子同源性很高,仅有个别氨基酸的差异。进一步采用半定量RT-PCR分析表明,BnPPT1基因在油菜各器官中表达差异很大,在幼嫩的子叶和茎中有较高丰度的表达,在中早期发育的种子中表达丰度逐步升高,种子成熟后期没有表达,暗示该基因在油菜籽粒中油份等物质积累中有重要功能。

摘要：[目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用改良CTAB法提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再通过两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。

摘要：[目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用SDS法和改良CTAB法(包括低温操作、增加酚氯仿的抽提次数以及延长低温沉淀时间等)提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再使用普通聚合酶与热启动高保真的ExTaqHS聚合酶进行两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。油菜数据库比对搜索采用BBSRCBrassicaDB上WU-BLAST2.0工具,拟南芥数据库比对分析采用TAIR数据库中WU-BLAST2.0工具。为验证FS4转基因中T-DNA插入位点的真实性,根据序列比对分析结果在T-DNA插入位点的左右两端分别设计引物FS4-L与FS4-R。分别采用3对引物pS2/FS4-L、pA2/FS4-R、FS4-L/FS4-R同时对T1代转基因FS4杂合体和非转基因对照植株的基因组进行PCR验证。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。