摘要：目的获得兔出血症病毒（浙江分离株）近20年间遗传变异概况,建立兔出血症病毒的RT—PCR检测方法。方法对1989～2006年间的7株RHDV浙江分离株的衣壳蛋白基因（VP60）进行了克隆与测序,并与国内、外RHDV的基因组序列进行了遗传比对和分析;根据兔出血症病毒株的VP60设计引物,对20只人工感染兔的实质脏器、全血和350只实验兔全血样本进行了检测。结果7株RHDV的VP60基因均由1740个核苷酸组成,编码580个氨基酸。它们与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0%～99.8%。系统发生树分析结果显示,RHDV可划分为2个大的基因群,浙江（中国）的RHDV分离株主要集中于C亚群。RT—PCR检测方法表明20只实验兔全部扩出预期条带,而350只实验兔全血检测中出现13只RHDV可疑样本。经血凝抑制试验检测,13例PCR阳性样品中有10个HAI阳性,3个阴性。检测敏感度达100%,特异性为99.12%,经统计检验,kappa=0.865,表明PCR检出RHDV的结果与HAI高度一致。结论RHDV基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势。我们建立的RT—PCR法可用于RHDV浙江分离株的检测,用RT—PCR检测全血中RHDV方法的建立为活体检测RHDV打下了基础。

摘要：目的建立念珠状链杆菌的实时荧光定量PCR检测方法,实现该菌在多种实验动物中的快速检测。方法根据NCBI公布的念珠状链杆菌序列,设计特异性引物和探针,通过对24株标准参考菌株的扩增,验证其特异性、敏感性和重复性。运用所建立的方法对小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、长爪沙鼠和树鼩的共823份呼吸道样本进行检测。结果用所建Taqman MGB荧光定量PCR方法在小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔中未检出念珠状链杆菌;检出普通级长爪沙鼠和树鼩中念珠状链杆菌的阳性率分别为1.5%(1/65)和61.7%(37/60)。结论本研究所建立的念珠状链杆菌Taqman MGB荧光定量PCR检测方法,能够对实验动物中念珠状链杆菌进行快速准确的检测,敏感性优于国标方法,为实验动物质量检测体系的完善奠定了基础。

摘要：目的基于TaqMan建立小鼠腺病毒(MAdV)特异的荧光定量PCR检测方法,用于调查长爪沙鼠和小鼠等实验动物中MAdV感染情况。方法从NCBI下载小鼠腺病毒(MAdV-A和MAdV-3)基因组序列,比对分析后选择保守性较好的基因设计引物和探针。筛选最佳引物对和探针,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证,运用所建立的方法对长爪沙鼠和野鼠的共41份样本进行检测。结果经特异性和灵敏度鉴定,在设计的3对引物探针中确定一对最佳引物探针MAD-3,可区分小鼠腺病毒与猴腺病毒、禽腺病毒和树鼩腺病毒等24种病原,MAdV质粒DNA最低检测限为4.5 copies/reaction;MAdV纯病毒液和病毒/组织模拟样本的最低检测限均为440 copies/reaction。结论建立的Taq Man荧光定量PCR检测方法特异、灵敏和稳定,可用于大鼠、小鼠、长爪沙鼠等实验动物及鼠源性生物制品MAdV的检测。

摘要：目的以小鼠肝炎病毒(MHV)为例,研究两种常用小鼠感染MHV后粪便中病毒核酸检测量与血清特异性抗体的变化,探讨实验动物病原微生物感染的检测设计。方法用MHV病毒核酸检测阳性的脏垫料持续饲养C57BL/6和BALB/c小鼠(n=20)28 d,进行脏垫料接触感染。之后所有小鼠使用无菌垫料进行单笼饲养,每周收集新鲜粪便和血清样本,经Taqman荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法检测后进行统计分析。结果对于BALB/c小鼠,采用qPCR法检测时,在实验第21天即有阳性检出(阳性率20%),第28天阳性检出率达到最高,为80%,第42天阳性检出率为50%,至第56天无阳性检出。血清ELISA检测发现,实验第42天才有MHV特异性抗体检出(阳性率为50%)。对于C57BL/6小鼠,采用qPCR法检测时,在第28天和第42天分别从20%小鼠粪便中检出MHV。而采用ELISA法在整个实验期均未检出特异性阳性抗体。结论在隔离检疫和常规病原检测中,建议选用BALB/c小鼠作为哨兵鼠,替代C57BL/6小鼠。由于qPCR法具有早检出和更高检出率的优点,建议在隔离检疫早期采用基于分子生物学的粪样核酸检测法替代ELISA法。

摘要：目的建立仙台病毒(SeV)的核酸测序检测方法。方法根据SeV序列设计覆盖不同毒株的通用引物,然后优化成测序引物并摸索建库条件,进行核酸测序和结果分析。结果获得1对特异性强的通用引物,序列为:上游引物5'-GCTGCAAAACGCTGTGGG-3',下游引物5'-TGGRACYTCAGAAAGAATRGG-3';建库条件优化为:第一轮以cDNA为模板用通用引物扩增,第二轮以第一轮产物为模板用测序引物扩增。测序分析可以有效地将SeV与其他微生物区分开,并且精确到TianJin亚株。结论建立了SeV核酸测序检测方法,为后续SeV感染实验动物的检验检疫提供依据。

摘要：根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)中基因库(GenBank)里查询到已登录的小鼠、大鼠的Tim-1mRNA序列,通过同源比较,设计引物,首次对长爪沙鼠Tim-1基因部分编码序列进行分子克隆.经过PCR扩增,获得长爪沙鼠Tim-1基因243bp部分编码序列,经测序后登录GenBank(JN628997),发现该序列与小鼠、大鼠Tim-1相应部分有80%以上的相似性.利用所克隆的序列设计引物,建立荧光定量PCR方法检测长爪沙鼠Tim-1基因在不同组织中表达情况.结果显示,长爪沙鼠Tim-1基因在不同组织中表达差异性较大,其中在肾脏组织中表达水平高于其他组织,在肌肉、心脏、小肠、脾脏、肝脏、肺组织中表达均较低.