摘要：乙酰胆碱酯酶是用酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的关键用酶,本研究利用毕赤酵母表达系统分泌表达人乙酰胆碱酯酶,并评估其对8种农药的敏感性,为工业化大规模生产高敏感性酶源奠定基础。根据GenBank上已发表的人乙酰胆碱酯酶(human acetylcholinesterase,hAChE)基因核酸序列设计引物,从pReceiver-M02-hAChE-ORF质粒中扩增出hAChE的开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,接着利用SnaBⅠ和AvrⅡ双酶切将其克隆至载体pPIC9K中,构建pPIC9K-hAChE表达载体,然后将SalⅠ线性化的pPIC9K-hAChE电转化至毕赤酵母GS115中,在含4.00mg/mLG418抗性平板上筛选获得阳性克隆,最后经0.5%甲醇诱导分泌表达144h,发现其发酵上清液的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱在65kDa处有一条明显的蛋白条带,大小与预期的hAChE蛋白一致。利用Q-Sepharose FF柱层析法对其总蛋白进行纯化,获得了较纯的人乙酰胆碱酯酶。用Bradford法测得发酵上清液中hAChE蛋白质量浓度为1.330mg/mL,占总蛋白的5.58%,纯化后比酶活达到1080nmol(/ min mL)。通过初步计算比对重组工程菌发酵上清液对8种常见农药的半抑制浓度,得出敌百虫>敌敌畏>克百威>马拉硫磷>乐果>甲胺磷>甲萘威>毒死蜱,即人乙酰胆碱酯酶对毒死蜱最敏感。

摘要：通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F1、R1和F2、R2,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2200bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用SalI线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0mg·mL^-1G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12h取样并添加甲醇,96h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示:在85kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37℃下培养90min,再加入IPTG至1mmol·L^-1后诱导7h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15U·mL^-1。