摘要：目的建立生物素标记探针和链亲和素磁珠分离人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）-A、-B、-C单体型的技术，以解决HLA分型过程中部分模棱两可的结果。方法根据IMGT／HLA数据库中HLA等位基因的序列信息，设计5’端生物素标记探针。将探针与104份标本基因组DNA混合杂交，然后加入链亲和素磁珠孵育，形成链亲和素磁珠一生物素探针一单链DNA复合物，通过洗涤和解析从而实施有效的分离。对分离出的单体型基因组DNA进行HLA-A、-B或-C位点扩增和测序分析。结果设计的12个HLA-A、19个HLA-B、13个HLA-C位点探针中，经测序证实分别有9个、9个、5个探针成功分离了单链DNA标本。结论建立的探针和磁珠分离HLAA、-B、-C单体型技术具有可行性，可以解决HLA测序分型中部分模棱两可结果，提高分型的准确性。

摘要：目的建立HLA-DPB1基因第2～3外显子测序方法，并分析其多态性。方法根据HLA-DPB1基因序列，设计位点特异性引物扩增242名浙江汉族人群HLA-DPB1第2～3外显子序列，PCR扩增产物经双酶切后对第2和3外显子进行双向测序分析，采用Assign3．5＋SBT分析软件判读HLA-DPB1等位基因型。结果PCR扩增获得特异性的单一目的片段，其产物经直接测序后得到清晰的序列图。242名浙江汉族人群中共检测到18个HLADPB1等位基因，频率超过0．05的等位基因为DPB1＊05：01：01／135：0l（0．4112）、DPB1＊02：01：02（0．1901）、DPB1＊04：01：01（0．1136）以及DPB1＊02：02（0．0620），并确认1个新等位基因DPB1＊168：01。在第3外显子中发现9个多态性位点，其中517A〉T为本实验新检出的1个多态性位点。结论本实验建立的HLA～DPB1第2～3外显子测序方法是可行的，HLA-DPB1第3外显子存在一定多态性。

摘要：目的探讨人类血小板同种抗原（human platelet alloantigen，HPA）-1～17w相关的血小板膜糖蛋白基因多态性。方法以自行设计的PCR引物特异性扩增HPA-1～17w相关的血小板膜糖蛋白基因片段，PCR产物经酶切纯化后直接进行DNA序列分析，根据序列特征确定HPA基因型和相应膜糖蛋白基因多态性。结果通过对112名随机汉族个体的糖蛋白基因序列分析，发现13个新的单核苷酸多态性位点和1个微卫星重复序列。其中ITGB3基因上的2个变异位点1333G／A和1960G／A引起膜糖蛋白GPⅢa的V419M和E628K氨基酸改变。结论膜糖蛋白基因具有多态性位点，可能引起膜糖蛋白结构的改变，同时可能影响现有部分HPA基因分型方法的准确性。

摘要：目的建立一种基于DNA扩增和测序分型（PCR sequencing—based typing，PCR—SBT）的人类血小板抗原HPA-1～HPA-16w的基因分型方法。方法从免疫多态性数据库中下载HPA-1-HPA-16w的全套HPA核酸序列，以Primer Premier 5．0软件设计引物，特异性扩增包含HPA—1a／1b到HPA-16aw／16bw多态性的核酸片段。通过调整引物序列和PCR条件获得单一的特异性扩增产物，PCR产物纯化后直接进行DNA序列分析并确定HPA基因型。通过对2份标准样本的HPA分型验证PCR-SBT方法的准确性；并利用PCR-SBT法对2008年度国际输血协会（ISBT）第14届国际血小板免疫学工作组提供的16份比对样本（包括6个含有基因突变的干扰样本）进行HPA基因分型。结果设计11对引物扩增和测序16个HPA系统。2份标准样本的HPA基因型分别为HPA：1aa／2aa／3ab／4aa／5ab／6aa．／7aa．／8aa／9aa／10aa／11aa／12aa／13aa／14aa／15aa／16aa和HPA：1aa／2aa／3aa／4aa／5aa／6aa／7aa／8aa／9aa／10aa／11aa／12aa／13aa／14aa／15aa／16aa。16份ISBT考核样本的256个HPA基因型结果清晰，其中HPA-1～HPA-6w、HPA-9w和HPA-15共8个系统的128个基因型结果与ISBT参考结果完全一致。结论建立了HPA-1～HPA-16w的PCR—SBT分型方法，结合高通量的DNA序列分析仪，具有简单、快速和准确的优点，适合于临床HPA全套基因分型，具有良好的应用前景。

摘要：目的建立1种9号染色体杂合性缺失(LOH)的分析方法,以解释因ABO基因附近染色体的LOH导致的疾病相关ABO抗原丢失现象。方法在9号染色体长臂和短臂上共选取13个微卫星位点,其中10个位点(D9S1677、D9S289、D9S1776、D9S1682、D9S290、D9S164、D9S1818、D9S1826、D9S158、D9S1838)位于ABO血型基因近端,平均间距5.52 cM;另3个位点(D9S1858、D9S171、D9S1843)位于ABO基因远端,平均间距39.3 cM。分别设计合成FAM和HEX荧光标记引物,优化PCR扩增后,以聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳,通过GeneMapper软件分析微卫星不稳定性,观察染色体LOH发生情况。结果 13个微卫星位点均得到了较好的PCR扩增效果,PCR产物长度在75～273 bp之间,各位点均有较高的杂合度,适合于微卫星片段长度分析。13个位点可在2个泳道中进行双荧光同步分析,各位点不同等位基因间互不干扰。分别对1例正常血型标本和2例血液病相关的ABO抗原变异标本(包括口腔黏膜DNA和外周血DNA)进行微卫星分析,正常血型标本的口腔DNA和外周血DNA未发现染色体LOH现象。而2例ABO抗原变异标本,与口腔黏膜DNA相比,外周血DNA均存在不同程度的LOH现象,表明ABO抗原丢失可能源于血液系统疾病相关的9号染色体LOH现象。结论建立了1种基于微卫星不稳定分析的9号染色体LOH方法,可用于血液系统疾病相关的ABO抗原丢失标本分子机制的研究。

摘要：本研究建立红细胞Kidd血型基因实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术以监测个体嵌合状态。根据红细胞Kidd血型等位基因的差异设计TaqMan MGB探针和特异性引物,进行实时荧光定量PCR检测个体嵌合状态,利用倍比稀释的方法模拟个体DNA嵌合状态并进行敏感性分析。结果表明,实时荧光定量PCR法可有效区分JK*A和JK*B等位基因。人工嵌合JK*A和JK*B的DNA标本实测值与理论值无显著差异(P>0.05)。在104个嵌合型细胞中存在156个供者型细胞时,该方法可有效检出供者型细胞。结论:建立的红细胞Kidd血型基因实时荧光定量PCR法检测嵌合体具有可行性,可以在一定范围内用于定量监测嵌合样本。

摘要：目的:建立重亚硫酸盐测序法(BSP法)定量分析ABO基因启动子区CpG岛的甲基化水平。方法:提取胃癌细胞株MKN45和KatoⅢ以及人全血基因组DNA,以重亚硫酸盐转化法修饰其DNA,应用Meth Primer软件在ABO基因启动子区非CpG位点区设计4对特异性甲基化扩增引物,将ABO启动子附近区域的CpG岛分成4个片段分别扩增,优化PCR扩增条件后进行T-A载体克隆和测序分析,采用BiQ Analyzer软件分析ABO基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果:PCR扩增获得了约2kb的完整CpG岛片段,共包含191个CpG位点,测序图谱证实亚硫酸盐转化修饰完全。MKN28细胞株整个CpG岛内191个检测的CpG位点全部甲基化,细胞株KatoⅢ甲基化比例为8.9%,随机标本DNA甲基化比例为30.4%。结论:建立的方法可检测出ABO基因启动子区CpG岛所有CpG位点的甲基化状况,定量分析其甲基化水平。

摘要：目的探讨利用双通道Taqman-MGB探针检测Kidd血型系统JKa、JKb等位基因的可行性。方法基于JKa、JKb等位基因在SLC14A1基因838G>A的差异,设计引物和Taqman-MGB探针建立JKa、JKb等位基因分型方法,并将基因分型与血清学分型结果进行比较。结果双通道TaqMan-MGB探针实时荧光PCR方法能有效检测JKa、JKb等位基因。在198例随机样本中,JKa等位基因频率为0.427,JKb为0.573,基因分型结果与血清学分型结果完全一致。结论建立了同步检测JKa、JKb等位基因的双通道实时荧光PCR方法。

摘要：目的MHCⅠ类链相关基因B（MICB）是非经典的HLAⅠ类分子,可与NKG2D相互作用调节NK细胞的活性。本研究旨在建立MICB基因2～6外显子的聚合酶链反应-序列测序方法（PCR-SBT）,并分析汉族人群MICB在高分辨基因分型水平上的分布特征。方法根据GenBank数据库MICB基因有关序列（ID NC000006.11）,采用Primer3input计算机软件辅助设计引物,利用聚合酶链反应扩增MICB基因2～6外显子序列片段,扩增片段采用双酶切纯化后,按BigDye terminator v3.1sequencing Kit试剂盒操作进行测序反应,利用Assign3.5SBT分析软件指定等位基因型。

摘要：目的本研究拟建立KIR2DL1基因分型和抗原分型技术,了解中国汉族人群KIR2DL1基因分布和抗原表达情况。方法收集166份新鲜外周血标本,分离单个核细胞,利用NK细胞特异性的CD56,和KIR2DL1特异性的CD158a抗体流式检测KIR2DL1抗原表达情况。提取标本的基因组,利用PCR-SSP技术检测KIR2DL1基因的有无,对于KIR2DL1基因阳性标本设计3对引物扩增1～9号外显子,并进行全长测序分析。结果1)166份标本中,164份标本KIR2DL1阳性,其中62份标本KIR2DL1和KIR2DS1双阳性,仅2份标本KIR2DS1单阳性。