摘要：【目的】建立菠萝凋萎相关病毒-3实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据PMWa V-3外壳蛋白基因的保守区域设计特异性引物和探针,通过优化PMWa V-3实时荧光定量PCR检测体系,构建以重组质粒为标准品的标准曲线,建立起PMWa V-3实时荧光定量PCR检测方法。【结果】该方法能特异性地检测PMWa V-3,且灵敏度是普通RTPCR的10倍;该方法重复性良好,组间和组内变异系数均小于1.73。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法是一种快速、简便、可信度高的PMWa V-3定量检测方法。

摘要：【目的】克隆菠萝AcFT基因并研究其表达模式,为深入研究该基因在乙烯利诱导菠萝成花中的功能奠定基础。【方法】从菠萝基因组数据库中获得AcFT基因全长序列,设计全长引物,克隆两个AcFT基因,分别命名为AcFT1和AcFT2,对基因序列进行生物信息学分析;通过qRT-PCR探究乙烯利处理后菠萝AcFT基因在不同组织、时间下的表达模式。【结果】AcFT1和AcFT2分别编码178和177个氨基酸,两者均含有PBP结构域,具有PEBP家族典型结构特征。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcFT1和AcFT2都具有组织表达特异性,在茎和叶中相对表达量较高;乙烯利处理后,AcFT1和AcFT2在茎和叶中的表达具有相反的趋势,其中AcFT2明显受到乙烯利上调,呈现先上升后下降趋势,AcFT1则显示为先下降后上升。乙烯利处理后1 d,茎尖组织AcFT2的表达水平显著上升,相对表达量约为对照的178倍,而AcFT1则明显下调;乙烯利处理后31 d,AcFT2在茎尖中的表达水平达到最大值,约为对照的408倍,但AcFT1却处于极低水平。【结论】克隆得到2个AcFT基因,AcFT2基因在乙烯利处理后1 d及随后的花芽分化时期高度表达,表明AcFT2在响应外源乙烯利信号诱导菠萝成花过程中发挥重要作用。

摘要：菠萝凋萎相关病毒(Pineapple mealybug wilt associated virus-2,PMWaV-2)是引起的菠萝凋萎病(Mealybug wilt of pineapple,MWP)的重要病原。本研究中根据PMWaV-2外壳蛋白基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能高灵敏检测出阳性样品,对阴性样品及空白对照均无荧光反应;灵敏度比普通PCR高100倍;重复性试验表明批内和批间变异系数均在1.85%以内,表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-2定量检测方法。

摘要：菠萝凋萎相关病毒-1(Pineapple mealybug wilt associated virus-1,PMWaV-1)是田间检出率最高的菠萝凋萎病毒。本研究根据PMWaV-1CP基因保守序列设计特异性TaqMan探针和引物,建立并优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化后的反应体系制备的标准曲线为y=-3.307×log x+38.18,相关系数r2为0.998。试验结果表明,该方法能特异性地检测PMWaV-1,对PMWaV-2、3和阴性对照均无反应;最低检测限达到40拷贝。重复性试验表明批内和批间变异系数均小于1.98%,是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-1定量检测方法。样品检测结果表明PMWaV-1在菠萝植株老叶、嫩叶和吸芽中的病毒含量呈递减趋势。

摘要：目前我国菠萝产区已相继报道3种菠萝凋萎相关病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3)。通过建立这3种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)同步定量检测方法,为菠萝凋萎病毒的定性定量研究提供技术手段。根据这3种菠萝凋萎相关病毒的外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物和Taq Man水解探针,在优化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR反应体系后,以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线,初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR检测方法。其中PMWaV-1标准曲线为y=-3.283logx+39.02,其扩增效率达101.7%,线性相关系数R2=0.999;PMWaV-2标准曲线为y=-3.393logx+37.53,其扩增效率为97.1%,线性相关系数R2=0.998;PMWaV-3标准曲线为y=-3.171 logx+38.48,其扩增效率为106.7%,线性相关系数R2=0.996;这表明3种菠萝凋萎相关病毒质粒标准品在同一反应体系中可稳定扩增,且线性关系表现良好,可用于后续试验。灵敏度试验数据表明,该方法对PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低检测线分别为99,98,868拷贝;重复性试验表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR扩增曲线的标准差小于0.267,变异系数小于1.44%。这表明建立的三重RT-q PCR检测方法可快速、准确、稳定地定量检测PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3种病毒,为PMWaV的定性定量研究和复合侵染机制的探索提供了技术基础。