摘要：为建立适用于羊源多杀性巴氏杆菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)诊断方法,本研究依据前期测序鉴定的羊源多杀性巴氏杆菌KMT1基因序列构建pET-28a(+)-KMT1质粒标准品。设计基于RPA技术的特异性引物及RPA荧光探针,建立实时荧光RPA方法的最适反应体系。采用10倍梯度连续稀释的质粒标准品检测该RPA方法的敏感性并绘制相关性曲线;以10种不同菌株的基因组DNA为模板验证方法的特异性;用感染多杀性巴氏杆菌的山羊及小鼠组织样品对方法的可靠性进行验证。结果显示,本试验建立的实时荧光RPA方法最适反应温度为39℃,最佳引物为KMT1-Fe1,灵敏度达100拷贝/μL,检测下限为10拷贝/μL。与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、绿脓杆菌、产酸克雷伯菌、布鲁氏菌S2株和鲍曼不动杆菌均无交叉反应。对13个组织样本进行检测,阳性率为76.9%,与实时荧光定量PCR检测结果的符合率达92.3%。综上所述,本研究建立的羊源多杀性巴氏杆菌实时荧光RPA方法具有特异性强、灵敏度高、可靠、快速便捷等特点,适用于多杀性巴氏杆菌的临床分子诊断。

摘要：本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1044bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a(+)-OmpA重组菌最佳诱导条件为1mmol/LIPTG37℃诱导6h,表达的重组蛋白大小约为40ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C1684H2619N457O505S3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。

摘要：为了研究马尔他布氏杆菌KdtA蛋白的功能,根据GenBank中公布的马尔他布氏杆菌M5-90株KdtA基因序列,利用DNAMAN软件设计上、下游引物,以M5-90株的基因组DNA为模板,采用PCR对其进行扩增,凝胶回收纯化后得到1 341bp的目的片段;然后构建克隆重组质粒pMD20-T-KdtA,将其转化到大肠杆菌DH5α;待测序正确后,构建原核表达质粒pET-28a(+)-KdtA,再将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对基因的表达情况进行分析检测。结果表明,成功克隆了KdtA基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了KdtA基因;经诱导后得到了预期的目的蛋白,证明KdtA基因得到了成功表达。

摘要：为了克隆马尔他布氏杆菌LpxK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中马尔他布氏杆菌M5-90株LpxK基因序列信息设计引物,从M5-90株基因组扩增出1 026bp的目的基因;然后将其连接入pMD20-T载体,转化入大肠杆菌DH5α并测序;测序正确后将目的基因连接入pET-28a(+)质粒,构建重组质粒pET-28a(+)-LpxK,并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a(+)-LpxK原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了LpxK基因,表达的融合蛋白大小约41ku且主要以包涵体形式存在。

摘要：为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶(SOD)的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a(+)载体相连,构建pET-28a(+)-sodA重组质粒,将该质粒转化*** DH5α感受态细胞进行克隆,再转化*** BL21(DE3)感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645bp的目的片段,并表达出大小约28ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07(GenBank登录号:CP007040.1)和Pm70(GenBank登录号:AE004439.1)株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C1085H1651N293O309S9,分子质量为24 032.36u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87(<40),在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30h,疏水指数为82.15,总平均疏水性(GRAVY)为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。

摘要：为研究日粮粗纤维水平对生长中期定安鹅腿肌MSTN基因表达量及肌纤维发育的影响,选遗传背景相近、体重一致的30日龄定安鹅120只,采用单因子随机试验设计,共分3个处理组,每处理组设4个重复,每重复10只鹅。分别饲喂粗纤维水平为4.29%,5.29%和6.29%的三种日粮。试验期为35 d。结果表明:(1)日粮粗纤维水平为5.29%时,可以提高生长中期定安鹅试验末重和平均日增重,并且与6.29%组比较达到了显著水平(P<0.05);(2)日粮粗纤维水平可以显著影响生长中期定安鹅腿肌中MSTN的基因表达量(P<0.05),且腿肌中MSTN的基因表达量与生长中期定安鹅的试验末体重和平均日增重呈负相关关系;(3)日粮粗纤维水平为5.29%时,与6.29%组相比可显著提高生长中期定安鹅血清中Ig A和Ig G的含量(P<0.05);(4)日粮粗纤维水平显著影响生长中期定安鹅腿肌纤维数量和腿肌纤维密度的影响(P<0.05)。综上所述,日粮粗纤维水平为5.29%可以显著影响生长中期定安鹅的试验末体重、平均日增重和腿肌中MSTN基因的表达水平,对腿肌纤维的发育也有一定的促进作用。

摘要：为克隆羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板,参照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因组DNA序列(登录号:NC_006351.1)设计引物,PCR扩增BPSS1512基因,构建重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting分析其蛋白表达,DNAMAN等软件对BPSS1512基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,PCR扩增成功得到1 425bp的特异性条带,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后得到约为5 000和1 500bp的条带,表明重组质粒pET-28a-BPSS1512构建成功,IPTG浓度为10mmol/L,诱导时间8h为最适宜的诱导条件。BPSS1512基因编码的蛋白质分子质量为53ku,在包涵体中表达;在BPSS1512蛋白二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规卷曲分别占24.05%、14.77%、61.18%,并且疏水性区域分布在-2.0^+2.4之间,说明BPSS1512蛋白具有较强的疏水性,本试验结果可为类鼻疽病的防制提供参考依据。

摘要：试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌(***)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化*** BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C1866H2968N544O562S15,分子质量为42 496.3u,理论等电点(pI)为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性(GRAVY)为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30h,其二级结构以α-螺旋(41.94%)和无规则卷曲(31.46%)为主。

摘要：试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到大小为1 188bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到*** DH5α感受态细胞中,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到*** BL21(DE3)中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。

摘要：试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列(登录号:CP007040.1),使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物,选取高保真酶PrimeSTARMax DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段,并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增产物约为615bp,编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高,而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现,羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现,ompW蛋白分子式为C1007H1567N257O283S3,分子质量为21.90ku,理论等电点(pI)为9.16,属碱性蛋白质,疏水指数为96.57,总平均疏水性(GRAVY)为0.173(>0),属于疏水类蛋白;前21位氨基酸为信号肽,第5-27位氨基酸区域存在1个跨膜区,存在N-糖基化位点及磷酸化位点,不存在O-糖基化位点,具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位;二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%;三级结构是呈β-桶状的单聚体,隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。