摘要：目的 克隆并表达芒果果实中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白（profilin）并了解其免疫学活性。方法 利用RT-PCR结合RACE技术克隆芒果果实中泛变应原profilin的全长基因，并进行序列分析。然后设计带有酶切位点的特异性引物，采用RT-PCR获得整个芒果profilin的开放阅读框，将其与pET-28a载体连接并转化大肠杆菌Escherichia coli B121（DE3）进行诱导表达，通过Ni^2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，采用Western blot检测其IgE结合活性。结果 克隆获得了芒果profilin的2个型。每个型的cDNA都包括一个编码131个氨基酸的开放阅读框。序列分析结果显示所克隆到的基因与许多水果和花粉的泛变应原profilin基因有很高的同源性（〉70％）。根据变应原的命名规则，将它们分别命名为Mani3．01和Mani3．02，并将这两个基因提交到GenBank数据库中，其登录号分别为DQ270547和DQ400579。重组芒果profilin在大肠杆菌中高效的表达，进一步经Ni^2＋亲和层析柱纯化后经Western blot检测具有良好的免疫学活性。结论成功地克隆和表达了芒果profilin，并证明与芒果过敏者血清有特异IgE应答。

摘要：目的构建粉尘螨6类变应原(Dermatophagoides farinae,Derf6)基因的高效原核表达载体,并进行表达、纯化及生物学功能分析。方法根据Derf6基因已知序列,设计1对引物,通过对纯培养的粉尘螨提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Derf6基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌(***10),经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Derf6和空质粒pET-24a同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,经纯化后连接并转化至***10。构建的重组质粒pET24a-Derf6经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至***21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Westernblotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET24a-Derf6表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Derf6和pET24a-Derf6。SDS-PAGE结果表明Derf6基因在***21(DE3)中获得良好的表达,所得重组蛋白相对分子质量(Mr)为31000,与理论值一致,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Westernblotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Derf6。

摘要：根据已公布的大豆种子Em基因(LEA1)的5′末端序列设计二个基因特异反向引物(EmS1,EmS2)。以大豆基因组DNA为模版,利用染色体步行(Chromosome Walking)法,获得了Em基因起始密码子上游836bp的特异DNA片段。进行序列测定和生物信息学分析。结果表明,这段DNA序列为一尚未在基因数据库登录的DNA片段。该序列含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,因此可能具有启动子活性。含有1个DRE1和2个ABRE,该启动子可能受到ABA和干旱等条件的诱导。含有1个AG-motif和1个ELRE-motif,该启动子可能参与创伤和诱导子等胁迫因素的应答。含有2个RY-repeat和1个TGTCACA-Motif,该启动子片段可能具有种子特异性。结果表明,所克隆到的片段可能为基因Em的诱导型启动子,并且很可能是种子特异性启动子。

摘要：克隆、表达红星梭子蟹蟹肉中变应原原肌球蛋白(Tropomyosin),并对其免疫学特性进行鉴定。RT-PCR克隆红星梭子蟹(Portunus sanguinolentus)蟹肉中变应原原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增蟹Tropomyosin的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接并转化大肠杆菌***21(DE3),诱导表达后,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western-blot检测其免疫学活性,胰酶消化后进行MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定。克隆所得蟹Tropomyosin基因包括一个编码285个氨基酸的开放阅读框。序列分析结果显示所克隆得到的基因与已知虾、螨、蟑螂等的Tropomyosin变应原基因有较高的同源性(>80%)。根据变应原的命名规则,将其命名为Pors1,并提交GenBank数据库,登录号为EF143836。重组蟹Tropomyosin在大肠杆菌中能高效的表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后进行Western-blot检测,结果显示该重组蛋白具有良好的免疫学活性,MALDI-TOF-MS质谱分析进一步证实了该重组变应原的正确性。本研究成功克隆和表达了红星梭子蟹变应原Tropomyosin,为蟹过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。

摘要：通过生物信息学方法对多种植物性食物和花粉泛变应原proflin基因进行比对,利用其中的高度保守区域设计并合成简并引物,通过RT-PCR克隆得到一个新的大豆profilin基因(396bp,pI为5.21,MW为14,1kD),序列同源性分析发现该基因和已知的多种植物性食物、花粉变应原profilin有较高的同源性(>75%),因此认为其系大豆蛋白泛变应原profilin,命名为Gly m3.02,EMBL/GeneBank数据库登录号为DQ784852,这为进一步重组表达和抗原表位分析等奠定了实验基础。

摘要：目的应用PCR技术检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1的基因。方法从深圳和北京地区分别收集20台、10台空调过滤网上的灰尘样品,分别提取其生物总基因组DNA作PCR模板,分别设计Der f1和Der p1各两套内外扩增引物分两步进行PCR,通过扩增出目的片段来检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因片段,并以深层泥土DNA提取物为阴性对照和以培养的粉尘螨、屋尘螨基因组DNA提取物为阳性对照。PCR产物经电泳后切胶回收目的片段并克隆到T载体上,进行DNA序列分析并与Gen Bank进行同源性比较分析。结果深圳地区20台空调空气滤网上收集的灰尘中均含有粉尘螨和屋尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因片段;北京地区10台空调空气滤网上收集的灰尘样品中,只有4份均含有Der f1和Der p1;它们扩增部分的序列与GenBank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段,从阳性对照的DNA提取物中分别扩增得到目的变应原Der f1和Der p1基因片段。结论本研究首次应用分子生物学技术证实了空调空气滤网上的灰尘中存在尘螨主要变应原Der f1和Der p1基因,并提示深圳地区空调过滤网灰尘中尘螨可能比北京地区的多,从而为今后防治空调中尘螨引起的变态反应性疾病提供了依据。

摘要：目的对APP／tau／PS1阿尔茨海默病（AD）转基因小鼠基因型进行鉴定，并研究在其病程进展中tau蛋白的病理变化。方法根据PSl、APP、tau基因序列设计特异性引物，PCR扩增对三转基因AD小鼠的基因型进行鉴定；免疫组化法对2、4、8个月龄小鼠大脑海马区tau蛋白表达进行检测；Western blot检测随着月龄增长小鼠海马组织的tau蛋白及其不同位点磷酸化水平。结果三转基因小鼠基因组PCR扩增获得片段分别为960bp、530bp和400bp，与APP、PSl、tau的预期条带大小相符；免疫组化检测发现，8月龄小鼠海马CA3区tau蛋白表达的阳性区域增加；Western blot检测发现，三转基因小鼠海马区tau蛋白及其ps262、ps404、ps202位点磷酸化水平均较正常野生型小鼠升高（P〈0．01），且随月龄增长，8、12个月龄小鼠tau蛋白表达较2个月龄均增高（P〈0．01）；Ps404及Ps202位点的磷酸化水平自2个月龄开始就高于野生型（P〈0．01），8个月龄时表达较2个月龄再次出现升高（P〈0．01），而Ps262位点的磷酸化水平直到12个月龄才较野生型出现显著性变化（P〈0．01）。结论三转基因小鼠能够稳定的遗传并表达APP／tau／PS，此三转基因动物能很好地模拟AD病tau蛋白的病理特征；tau蛋白及各位点磷酸化水平增高的时间并不一致，8个月龄可能是一个关键的时间点，这将为今后应用此动物模型进行的的病理及靶向治疗药物研究提供科研参考。

摘要：根据原肌球蛋白基因序列设计引物,以我国南方地区美洲大蠊Periplaneta americanaRNA为模板,用RT-PCR方法扩增出852bp的全长编码片段,经序列分析发现该基因与NCBI公布的Per a7有3个核苷酸发生改变。将目的片段克隆到pET24a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21Star获得表达,融合蛋白的分子量约为33kD。利用蟑螂过敏性患者血清对表达产物进行Western blotting检测,出现明显的识别条带,说明表达产物具有IgE结合活性。

摘要：对嗜碱科式芽孢杆菌(alkaliphilic Bacillus cohnii,DSM6307)芽孢形成的影响因素进行了研究.单因素实验结果表明,蔗糖为最适碳源,最佳质量浓度为1.0 g/L;牛肉膏为最适氮源,最佳质量浓度为3.0 g/L;Mn2+最适质量浓度为3.2 mg/L;Mg2+最适质量浓度为0.12 g/L;最适温度为30℃;装液量为50 m L(250 m L锥形瓶).运用Plackett-Burman法研究了碳源、氮源、微量元素、温度和装液量5个因素对DSM6307产芽孢数的影响,结果表明,碳源、氮源和Mn2+是影响DSM6307芽孢产量的显著因子.运用中心组合设计实验对这3种显著因子进行优化后,应用响应面模型测出蔗糖、牛肉膏和Mn2+的最优质量浓度分别为1.30 g/L、3.29 g/L和11.48 mg/L,预测芽孢数为1.67×109m L-1.在此优化条件下,实验得到的芽孢数为1.50×109m L-1,与预测值接近.

摘要：本文克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)细胞色素P450(cytochrome P450)基因全长,表达重组蛋白,并对其可溶性进行了分析。通过提取东亚飞蝗总的RNA,反转录成cDNA,设计特异性引物,PCR克隆东亚飞蝗细胞色素P450基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达结果。结果表明:东亚飞蝗细胞色素P450基因开放阅读框全长为1 551 bp,编码516个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗细胞色素P450基因(HM153426)的同源性为99%,重组质粒pET-28a-P450在*** Rosetta中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为53 000,主要以包涵体的形式存在。