摘要：目的建立猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,应用于食品和食物中毒病人标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断。方法根据GenBank公布的猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的保守序列(CP000857.1),设计引物和改良分子信标探针,优化PCR程序和PCR成分,以11种细菌为对照,建立实时荧光PCR检测方法,并用71株常见血清型的沙门菌评价该方法的灵敏度和特异性,所建立的方法应用于70份食品样品的检测。结果该改良分子信标—荧光PCR方法的DNA最低检出限为10fg/反应体系,菌液最低检出限为20 CFU/反应体系;无交叉荧光信号产生。针对目标菌均出现特异荧光信号。对71株沙门菌属的检测,该方法的灵敏度和特异度为100%。70份食品样品用荧光PCR和传统方法检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌,结果均为阴性。该方法从菌株的核酸提取到检测仅需1.5小时,从样品处理到检测仅需1天时间。结论建立的实时PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于食品及食物中毒标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断,保障食品安全。

摘要：目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HP1基因;HP1基因与载体pFastBac1连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Western blot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBac1载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×103 Mr的目的蛋白条带,经Western blot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。

摘要：目的利用实时荧光定量RT-PCR建立快速检测人腺病毒(HADV)、人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)等四种呼吸道病毒的方法。方法寻找四种呼吸道病毒的相对保守序列,针对该序列分别设计4对引物对及其相应的Taqman探针,将此保守序列作为目的基因片段,使用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系;采用10倍稀释体外转录RNA,检测建立的体系的灵敏度和重复性并建立反应体系标准曲线;通过临床样本检验体系的特异性。结果 HADV、HBoV、HMPV、HRSV四种病毒的检测灵敏度均为10 copies/μl,标准曲线的决定系数分别为:HADV R2=0.9998,HBoV R2=0.9981,HMPV R2=0.9981,HRSV R2=0.9947和0.9965,扩增效率分别为:HADV 105.08%,HBoV 107.81%,HMPV 102.08%,HRSV FAM荧光106.38%及CY5荧光107.95%。荧光RT-PCR反应体系检测体外转录的RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低,对临床样本检验的特异性为100%。结论本研究建立的实时荧光定量RT-PCR体系可快速、准确地检测人HADV、HBoV、HMPV、HRSV等四种呼吸道病毒,且重复性较好,特异性高。