摘要：文章利用绿色荧光蛋白基因作为报告基因,研究2个螺旋藻耐盐相关基因启动子区域的功能。通过启动子预测软件预测螺旋藻耐盐相关基因5′端非翻译区的启动子结构,用Primer3.0程序在线设计引物,以pMD18-T载体和pUC18载体克隆螺旋藻启动子序列、gfp和卡那霉素抗性基因,将螺旋藻启动子-GFP基因-卡那霉素抗性基因（pro-gfp-kanr）三联DNA片段克隆至pKW1188载体,并将该重组质粒pKW1188：：pro：：gfp：：kanr转化至受体菌集胞藻6803,激光共聚焦显微镜观察不同盐浓度培养条件下、不同时间段集胞藻表达GFP的情况。结果显示,通过不同盐浓度和不同时间的诱导,2个螺旋藻启动子在0.4~0.6 mol/L NaCl条件下,培养6~8 h表达的绿色荧光蛋白最多。文章成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因、卡那霉素抗性基因为选择标记、集胞藻6803作为外源基因表达受体,进行螺旋藻耐盐相关基因功能研究的平台;另外,从螺旋藻启动子能被盐诱导大量表达GFP的结果看,与启动子相关的螺旋藻基因很可能与螺旋藻的耐盐性相关。

摘要：目的建立DHPLC技术分析PCa特异性PCA3基因启动子多态性的技术平台。方法在PCA3基因启动子区域设计1对引物，以本室先前已经建立的11种（C2T6、C2T5、C3T5、C2T5／C2T6、C3T5／C3T4、C3T5／C4T5、C3T5／C2T5、C3T5／C2T6、C3T5／C1T8、C2T5／C3T4、C2T6／C2T7）已知多态性的PCA3基因启动子的克隆质粒为标准品，通过优化DHPLC检测体系，建立其多态性克隆质粒的标准图谱。采用完全随机设计，从200例病理确诊为PCa患者中选取147例，对其PCA3基因启动子的扩增产物进行DHPLC分析，比较各标本洗脱峰与标准克隆质粒的DHPLC图谱，以判断临床标本PCA3基因多态性类型，并对这些基因型再行克隆测序予以验证。结果通过克隆质粒优化DHPLC检测体系，最适检测体系为：含44．3％A洗脱液（0．1mol／L TEAA、0．025％ACN）和55．7％B洗脱液（0．1mol／L TEAA、25％ACN）的起始洗脱梯度，含35．3％A洗脱液和64．7％B洗脱液的终止洗脱梯度，柱温53℃，流速：0．9ml／min，在该条件下DHPLC用8种杂合型克隆质粒（C2T5／C2T6、C3T5／C3T4、C3T5／C4T5、C3T5／C2T5、C3T5／C2T6、C3T5／C1T8、C2T5／C3T4、C2T6／C2T7）进行重复性验证，结果显示，同一多态性色谱峰中2峰的出峰时间之差的批间CV值在0％～6．67％之间。11种克隆质粒多态性标本仅通过1～2次洗脱，就能根据峰型和各峰的出峰时间将其区分开。147例PCa患者中，144例DHPLC检测结果和克隆测序结果一致（Kappa=1，P=0．000），并出现3种新的峰型，经克隆测序验证为3种新的多态性（C3T5／C1T6、C2T5／C1T8、C3T5／C2T7）。结论成功建立的DHPLC分析PCA3基因启动子多态性的技术方法，可对PCA3基因启动子多态性进行基因型别鉴定。该方法具快速、准确、经济、高通量、重复性好、自动化等特点，为进一步研究PCa基因多态性提供了技术平台。