摘要：为了构建肿瘤靶向性的人突变型IL18新基因并进行真核表达,以重组PCR技术构建EGFIL18融合基因,利用BactoBac杆状病毒表达系统和Sf9昆虫细胞株(来自秋天草地夜蛾)表达融合基因,纯化表达产物,并以IFNγ诱导实验和EGFR竞争结合实验初步评价融合蛋白的生物活性。测序证明构建的融合基因为原设计EGFIL18融合基因。SDSPAGE和Westernblot证明EGFIL18融合基因在昆虫细胞中获得表达,表达的融合蛋白的Mr约为20000,与理论值相符,纯化后融合蛋白具有特异的IL18单抗结合活性。IFNγ诱导实验和EGFR竞争结合实验显示,该融合蛋白具有肿瘤导向性和抗肿瘤活性。表明对突变型IL18成功地进行了肿瘤导向性改造并使其在真核细胞获得表达。

摘要：目的 :建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术 ,定量检测人IL 18mRNA。方法 :针对人IL 18mRNART PCR产物一条链的不同区域序列设计一对特异探针 ,其中一条为捕获探针 ,5’端为氨基修饰 ,可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合 ,“竖直”地包被在微孔板内 ;另一条为检测探针 ,3’端标记生物素。提取人外周血单个核细胞中总RNA ,进行RT PCR扩增IL 18mRNA ,产物热变性后加入已包被捕获探针的微孔板内进行杂交 ,再加入检测探针与已杂交的产物结合 ,最后经亲和素 辣根过氧化物酶 (SAV HRP)系统检测杂交信号。结果 :该法检测IL 18mRNART PCR产物的灵敏度明显高于琼脂糖凝胶电泳 ,重复性良好 ,且结果数据化。结论 :该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点 ,适合于PCR扩增产物的定量检测。

摘要：呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿时期急性下呼吸道感染最主要的病原体[1].近年发展起来的实时聚合酶链反应技术具有灵敏度高、特异性好、方法简便等特点,广泛应用于病原体的检测[2].为此,我们设计并建立了用SYBR GreenⅠ实时逆转录PCR结合融解曲线分析快速鉴别呼吸道合胞病毒A、B亚型的方法。

摘要：目的：建立实时定量RT—PCR检测人转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)的方法，对慢性肝炎肝纤维化患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中TGF-β1 mRNA进行定量检测。方法：在TGF-β1基因的外显子1和2之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针；构建TGF-β1质粒克隆，以T7 RNA聚合酶体外转录合成带有目的片断的cRNA作为标准品，根据10倍系列稀释cRNA标准浓度对数和其循环域值(Cycle threshold，Ct)制作标准曲线，检测PBMC中TGF—β1 mRNA含量；并对本方法进行方法学评价。结果：重组质粒测序显示插入的片断为TGF—β1 mRNA特异性片断，成功的建立了实时定量RT—PCR检测TGF-β1 mRNA方法，灵敏度达6．81拷贝，线性范围为6．81～6．81×10^8拷贝，且重复性好，批内、批间变异系数分别为1．28％-2．27％和2．56％-2．61％，临床应用显示，27例肝纤维化病人PBMC中TGF-β1表达量为1．20×10^8(1．80×10^7～9．80×10^7)拷贝数／10^5细胞，显著高于正常对照组3．30×10^7(7．24×10^6～5．00×10^7)拷贝数／10^5细胞(P<0．05)。结论：实时定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA具有敏感、特异、快速、高效等特点，为TGF—β1 mRNA作为肝纤维化的诊断指标提供方法学依据。

摘要：目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达 TNF-α mRNA 的方法。方法根据 Gene Bank 中 TNF-α mRNA 序列和 MGB 探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物和探针,优化实验条件,建立定量检测人 TNF-α mRNA 的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后进行 TNF-α表达检测。结果本法灵敏度为10~3拷贝/毫升、线性检测范围达6个数量级(10~3～10~9拷贝/毫升);特异性好,PCR 产物电泳后无非特异性条带产生,非目的扩增产物用本法进行检测,均无荧光信号响应;以 Ct 值计算变异系数(CV 值),批内批间 CV值均小于5%;10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后 TNF-α mRNA 的平均含量分别为10^(4.15±0.49)和10^(5.19±0.43)拷贝/毫升。结论Taqman-MGB 实时荧光 RT-PCR 定量检测人 TNF-α mRNA 表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值。

摘要：目的:构建带有EGF受体干扰序列的人IL-18融合基因并预测其表达产物的二级结构。方法:利用分子生物学技术,将人IL-18的成熟肽序列cDNA与EGF受体干扰序列cDNA融合,构建重组体EGF-IL18。应用蛋白质分析软件对融合基因翻译后在二级结构水平上的一些生物学特性加以预测。结果:测序表明融合基因序列与设计一致。其相应的氨基酸序列经软件分析,并与人IL-18的成熟肽单独的分析结果相比较,发现在二级结构水平几乎没有变化,融合过程未影响IL-18的活性。结论:该融合基因可进一步用于导向多肽EGF-IL8的基因工程。

摘要：目的 :探讨脂多糖 (LPS)对人单个核细胞表达白细胞介素 6 (IL 6 )mRNA的影响。方法 :抽取人外周静脉血 ,经EDTA抗凝 ,LPS刺激培养 ,分离单个核细胞并提取总RNA ,将总RNA逆转录为cDNA ,然后用IL 6引物进行热启动PCR扩增。扩增产物热变性后与IL 6检测探针、捕获探针进行夹心杂交 ,最后加入亲和素 辣根过氧化物酶及其底物 ,显色检测杂交信号。IL 6引物及探针用PrimerPremier 5 .0软件设计。结果 :LPS可在转录水平上诱导IL 6mRNA表达 ,其作用强度与LPS剂量呈正相关 ;IL 6mRNA表达丰度有时间效应 ,刺激 4h后 ,IL 6mRNA的表达最高。结论 :LPS能显著增强人单个核细胞表达IL 6mRNA。

摘要：目的:建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术,对人iNOS—mRNA进行定量检测。方法:设计两条特异探针,其中一条为用捕获探针,5’端连接氨基,能与微孔板表面的NOS基团共价结合,"竖直"地包被在微孔中,另一个为检测探针,3’端带有生物素标记。用脂多糖(LPS)刺激人外周血单个核细胞24h后,提取巨噬细胞总RNA,进行RT—PCR扩增,PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内,并加入检测探针进行夹心杂交,最后加入链亲和素—辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物,在450nm波长检测杂交信号。结果:该方法检测iNOS—mRNA的灵敏度明显高于RT—PCR—琼脂糖凝胶电泳;特异性高,RT—PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现;重复性良好。结论:本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化,适合于iNOS—mRNA的定量检测。