摘要：目的建立实时荧光聚合酶链反应（Real-time PCR）方法检测腺病毒，并分析浙江省温州地区散发性婴幼儿腹泻患者不同型别腺病毒的感染情况。方法根据GenBank中腺病毒六邻体基因序列设计一对通用引物，建立Real-time PCR方法检测婴幼儿腹泻标本中腺病毒DNA，并与免疫层析法比较；同时对Real-time PCR方法检测阳性的标本进行PCR产物测序和病毒分离培养及酶切鉴定。结果建立快速、特异检测婴幼儿腹泻标本中腺病毒DNA的Real-time PCR技术。157份婴幼儿腹泻标本中免疫层析法检测阳性3份，阳性率为1．91％；Real-time PCR检测阳性5份，阳性率为3．18％（5／157）；154份免疫层析法检测阴性标本中，有2份Real-time PCR法检测为阳性。5份Real-time PCR检测阳性标本经测序鉴定，Ad3型占1．91％（3／157），Ad7型占1．27％（2／157）；经病毒分离培养检出阳性2例，酶切鉴定为Ad3型。结论Real-time PCR技术结合PCR产物直接测序分析具有敏感、特异等优点，适用于腹泻标本中腺病毒的检测及分型。2008年2—4月浙江省温州地区散发性婴幼儿腹泻的腺病毒主要为Ad3型和Ad7型。

摘要：目的对经API细菌鉴定条所证实的眼源性蜡样芽孢杆菌进行溶血素BL（HBL）基因鉴定并进行体外毒理性试验。方法根据溶血素结合亚基B、2个溶血亚基L1、L2三种组分的基因核苷酸序列，设计合成3对特异性引物，通过体系和条件优化，建立PCR检测方法，并对5株临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌进行检测分析；随机选取其中1株菌，利用盐析法提取溶血素，并以不同浓度剂量作用于绵羊红细胞、Vero细胞和Hela细胞，监测其对细胞的毒性；通过腹腔注射观察HBL对小鼠的致死作用，评估其毒力的强弱。结果5株临床分离菌中，共检出3个基因；蜡样芽孢杆菌溶血素BL蛋白具有较强溶血活性，其溶血活性呈明显的时间一剂量依赖性；BL溶血素对Vero细胞和Hela细胞的作用所致的形态变化虽有不同，但结果均导致细胞死亡，其内容物释出；对小鼠的致死率同样存在时间-剂量依赖性，且2．0HU／ml浓度以上的BL溶血素可使小鼠48h的致死率达100％。结论HBL具有较强的溶血活性，对临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌BL基因进行检测，3个基因均表达，为该菌感染后病情发展迅速、预后较差的临床表现提供了理论依据，同时为该病的快速诊断和分子流行病学调查提供了新的方法。

摘要：为了构建肿瘤靶向性的人突变型IL18新基因并进行真核表达,以重组PCR技术构建EGFIL18融合基因,利用BactoBac杆状病毒表达系统和Sf9昆虫细胞株(来自秋天草地夜蛾)表达融合基因,纯化表达产物,并以IFNγ诱导实验和EGFR竞争结合实验初步评价融合蛋白的生物活性。测序证明构建的融合基因为原设计EGFIL18融合基因。SDSPAGE和Westernblot证明EGFIL18融合基因在昆虫细胞中获得表达,表达的融合蛋白的Mr约为20000,与理论值相符,纯化后融合蛋白具有特异的IL18单抗结合活性。IFNγ诱导实验和EGFR竞争结合实验显示,该融合蛋白具有肿瘤导向性和抗肿瘤活性。表明对突变型IL18成功地进行了肿瘤导向性改造并使其在真核细胞获得表达。

摘要：目的建立PCR检测眼源性蜡样芽孢杆菌,了解不同vrrA基因型蜡样芽孢杆菌感染与临床病情和预后关系。方法选择vrrA为靶基因设计引物,建立检测蜡样芽胞杆菌PCR。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测并进行序列测定。采用Clustal软件对获得的vrrA基因序列进行分型。对不同vrrA基因型蜡样芽胞杆菌感染与眼内炎患者病情严重程度及转归分析与比较。结果所建立的PCR可有效检测眼源性蜡样芽胞杆菌并有较高的敏感性和特异性。5株分离自眼内炎患者标本中的蜡样芽胞杆菌可分为MT1、MT2、MT3三种vrrA基因型,其中MT1、MT2型各2株,MT3型1株。MT1和MT2型蜡样芽胞杆菌感染性眼内炎病情重、预后差,MT3型蜡样芽胞杆菌感染性眼内炎病情较轻、预后较好。结论 vrrA基因为靶基因的PCR可用于眼源性蜡样芽孢杆菌快速检测。不同蜡样芽孢杆菌vrrA基因型感染所致的眼内炎病情严重程度及转归有明显差异。

摘要：文章利用绿色荧光蛋白基因作为报告基因,研究2个螺旋藻耐盐相关基因启动子区域的功能。通过启动子预测软件预测螺旋藻耐盐相关基因5′端非翻译区的启动子结构,用Primer3.0程序在线设计引物,以pMD18-T载体和pUC18载体克隆螺旋藻启动子序列、gfp和卡那霉素抗性基因,将螺旋藻启动子-GFP基因-卡那霉素抗性基因（pro-gfp-kanr）三联DNA片段克隆至pKW1188载体,并将该重组质粒pKW1188：：pro：：gfp：：kanr转化至受体菌集胞藻6803,激光共聚焦显微镜观察不同盐浓度培养条件下、不同时间段集胞藻表达GFP的情况。结果显示,通过不同盐浓度和不同时间的诱导,2个螺旋藻启动子在0.4~0.6 mol/L NaCl条件下,培养6~8 h表达的绿色荧光蛋白最多。文章成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因、卡那霉素抗性基因为选择标记、集胞藻6803作为外源基因表达受体,进行螺旋藻耐盐相关基因功能研究的平台;另外,从螺旋藻启动子能被盐诱导大量表达GFP的结果看,与启动子相关的螺旋藻基因很可能与螺旋藻的耐盐性相关。

摘要：目的 结合纳米技术,构建一种可以快速比色检测肠致病性大肠埃希菌的适配体生物传感器.方法 对已有的适配体序列进行截短设计,将截短后的适配体通过酰胺化反应修饰到PDA纳米囊泡的表面,实现生物传感器的组装.利用适配体与LPS间特异性结合和结合后引起PDA纳米囊泡的颜色变化和比色响应值（CR）改变来定性或定量检测溶液中的肠致病性大肠埃希菌.并通过透射电子显微镜对PDA纳米囊泡与肠致病性大肠埃希菌之间的作用进行验证.结果 成功获得具有结合肠致病性大肠埃希菌功能的适配体截短序列;成功构建可以快速比色检测肠致病性大肠埃希菌的适配体生物传感器,并经透射电镜证实.其不需要特殊仪器,操作简便,检测时间短,仅需30 min;灵敏度较高,检出限为105 CFU/ml,线性范围为105～108CFU/ml;稳定性高,对106 CFU/ml菌液检测的相对标准偏差为6.08%;特异性强,对肠致病性大肠杆菌0111的检测的特异性为100%.结论 本研究成功构建了肠致病性大肠埃希菌适配体生物传感器,实现对肠致病性大肠埃希菌的快速比色检测.

摘要：目的 :建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术 ,对人iNOS -mRNA进行定量检测。方法 :设计两条特异探针 ,其中一条为捕获探针 ,5’端连接氨基 ,能与微孔板表面的NOS基团共价结合 ,“竖直”地包被在微孔中 ,另一个为检测探针 ,3’端带有生物素标记。用脂多糖 (LPS)刺激人外周血单个核细胞 2 4h后 ,提取巨噬细胞总RNA ,进行RT -PCR扩增 ,PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内 ,并加入检测探针进行夹心杂交 ,最后加入亲和素 -辣根过氧化物酶 (AV -HRP)及底物 ,在 4 5 0nm波长检测杂交信号。结果 :该方法检测iNOS -mRNA的灵敏度明显高于RT -PCR -琼脂糖凝胶电泳 ;特异性高 ,RT -PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现 ;精密度良好。结论 :本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化 ,适合于iNOS

摘要：目的:建立Bcl-2基因甲基化特异的PCR(MSP)检测方法,并探讨乳腺癌bcl-2甲基化与蛋白表达、 预后因素(肿瘤大小,淋巴结转移,增殖细胞核抗原PCNA,雌、孕激素受体ER、PR情况)的关系。方法:设计bcl-2基 因MSP引物,采用MSP方法检测54例乳腺癌bcl-2基因5’端启动子CpG岛甲基化状态。采用免疫组化S-P法检 测54例乳腺癌bcl-2、PCNA、ER、PR的表达。结果:乳腺癌bcl-2甲基化率为29．6％。Bcl-2甲基化与其蛋白表达 之间呈显著负相关(P<0．01)。Bcl-2甲基化率高与不良的预后因素(PCNA标记指数LI高、ER-和PR-)显著相关 (P<0．01)。结论:该研究建立bcl-2基因MSP检测方法,MSP扩增和测序结果证实,bcl-2基因MSP引物设计是合 理的。bcl-2甲基化有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。

摘要：目的 :建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微板酶联夹心杂交技术 ,对人单核细胞分泌的TNF -αmRNA进行定量检测。方法 :设计两条特异探针 ,其中一条为捕获探针 ,5’端带有氨基修饰 ,可以与微量DNA结合板表面的NOS基团共价结合 ,而且是“竖直”地包被在微孔内 ,另一个为检测探针 ,3’端带有生物素标记。提取人单个核细胞总RNA ,RT -PCR后的扩增产物经变性后加入已包被好捕获探针的微孔板中 ,加入检测探针与已杂交的产物结合 ,最后加入亲和素 -辣根过氧化物酶 (avidin -HRP)显色系统催化底物显色 ,4 5 0nm波长下检测吸光度进行定量。结果 :该方法检测TNF -αmRNA的灵敏度 ,明显高于琼脂糖凝胶电泳 ,而且具有良好的重复性 ,等量PCR产物作 10个复孔 ,吸光度的CV值为 7 2 % ,批间的CV值为 9 1%。在本实验中 ,我们首次尝试着用客观的数据来表示正常人中 1× 10 6个PBMCs中TNF -αmRNA的平均表达量 ,发现该表示方法直观明了 ,结果稳定 ,而且简便可行 ,不需要特殊的仪器及昂贵的试剂。结论 :本方法具有高灵敏度、高特异性、精确、简单易操作 ,结果数据化等优点 。

摘要：呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿时期急性下呼吸道感染最主要的病原体[1].近年发展起来的实时聚合酶链反应技术具有灵敏度高、特异性好、方法简便等特点,广泛应用于病原体的检测[2].为此,我们设计并建立了用SYBR GreenⅠ实时逆转录PCR结合融解曲线分析快速鉴别呼吸道合胞病毒A、B亚型的方法。