摘要：目的分析在第二代嵌合抗原受体(CAR)的基础上设计的同时分泌白细胞介素7(IL7)和趋化因子19(CCL19)的第四代嵌合抗原受体T细胞(CAR-T),在多发性骨髓瘤微环境中增殖、趋化、清除肿瘤细胞和持久性等方面的能力。方法通过2A自剪切肽技术构建第四代CAR载体质粒,采用第三代慢病毒包装系统制备高滴度慢病毒,通过流式细胞术检测慢病毒转导效率和CAR-T细胞亚型的变化;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测CAR-T细胞中IL7和CCL19的分泌情况;手工计数法分析CAR-T细胞在培养过程中的增殖活性;Transwell迁移实验验证CAR-T细胞趋化能力;荧光素酶生物发光法检测CAR-T细胞特异性杀伤活性;小鼠异体移植模型验证CAR-T细胞体内抗骨髓瘤活性和安全性。结果流式细胞术结果显示,抗CS1 CAR-T和抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞CAR的表达率分别为(91.50±0.29)%和(46.70±0.12)%,表明CAR-T细胞构建成功。亚型分析显示,抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞中T记忆干细胞(TSCM)的比例为(67.58±0.59)%,高于抗CS1 CAR-T[(50.74±1.01)%,P=0.000 1],具有更强的免疫记忆功能,持久性更佳。抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞较对照组(MOCK-T)和抗CS1 CAR-T组能够持续分泌IL7和CCL19(P<0.000 1)。抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞在慢病毒转导后的第9天细胞数达到(22.77±0.79)×106个,高于抗CS1 CAR-T细胞[(9.40±0.79)×106个,P=0.000 1],具有更强的增殖能力。Transwell迁移实验中,抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞对于反应T细胞的趋化细胞数为(109.00±4.04)个/视野,高于对照组和抗CS1 CAR-T组[分别为(9.33±1.20)个/视野和(7.33±0.88)个/视野,均P<0.000 1],具有更强的趋化能力。杀伤实验结果显示,与对照组细胞比较,抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T和抗CS1 CAR-T均具有特异性的杀伤效能(P<0.000 1)。动物实验表明,抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞降低了荷瘤小鼠的肿瘤负担(P<0.000 1),并延长了总生存时间(P=0.006 1)。结论第四代抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞在不影响体内外抗骨髓瘤活性的情况下,有着更强的增殖活性、趋化能力和持久性,为克服传统CAR-T细胞存活率低下、持久性差以及受肿瘤微环境抑制等缺陷提供了策略,为第四代CAR-T细胞的临床应用提供了前期实验依据。

摘要：构建编码NMDAR1蛋白膜外片段的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达、纯化并鉴定其免疫反应原性。根据人NMDAR1基因序列,利用Phyre 2软件预测蛋白的三级结构并分析其结构域。设计引物用RT-PCR方法扩增编码NMDAR1膜外蛋白不同结构域的核酸片段,并插入原核表达载体pCold-SUMO构建重组质粒。转化DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定,阳性单克隆进行测序验证。鉴定正确的重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达和纯化,Ni-NTA柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,酶切切除融合蛋白6His-SUMO标签,用AKTA Purifier进行凝胶过滤层析,收集纯化蛋白。利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,并用Western blotting进行免疫反应性鉴定。克隆获得NMDAR1膜外部分的三段DNA序列,分别是NR1-M1(编码19–393 aa)、NR1-S1(编码394–544 aa)和NR1-S2(编码663–800 aa)。其中NR1-S1和NR1-S2片段之间以G(甘氨酸)和T(苏氨酸)作为接头连接成为复合片段。经菌落PCR筛选和测序鉴定,成功构建了重组质粒p Cold-SUMO-M1和p Cold-SUMO-S1-GT-S2。SDS-PAGE鉴定结果表明重组质粒在大肠杆菌中经诱导可表达可溶性NR1-M1及NR1-S1-GT-S2蛋白。对表达产物进行亲和层析和凝胶过滤层析获得了高纯度的目标蛋白。Western blotting证实纯化的目的蛋白能与相应抗体发生特异性结合反应。本研究成功构建了NMDAR1蛋白膜外抗原结构域的原核表达系统,并获得了具有免疫反应性的NR1-M1及NR1-S1-GT-S2纯化蛋白。该蛋白有望用于NMDAR1蛋白的功能研究及自身抗体的检测。

摘要：目的 评价黏菌素分别与美罗培南、左氧氟沙星和磷霉素联用对黏菌素异质性耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性.方法 收集2014—2015年温州医科大学附属第一医院临床分离的576株鲍曼不动杆菌,采用微量肉汤稀释法检测黏菌素对鲍曼不动杆菌最小抑菌浓度（MIC）,并采用菌谱分析法（PAPs）筛选黏菌素异质性耐药鲍曼不动杆菌.通过棋盘法设计和微量肉汤稀释法检测黏菌素分别与美罗培南、左氧氟沙星和磷霉素联用及各自单用时对黏菌素异质性耐药鲍曼不动杆菌的MIC值,并通过计算部分抑菌浓度指数（FICI）评价联合抑菌效果.结果 通过微量肉汤稀释法检测的576株鲍曼不动杆菌中,未获得黏菌素耐药菌株.通过PAPs筛选共获得9株黏菌素异质性耐药鲍曼不动杆菌,黏菌素与美罗培南、左氧氟沙星和磷霉素联用后对异质性耐药菌株的MIC值较单用时均降低.其中,与美罗培南联用后对黏菌素异质性耐药鲍曼不动杆菌的联合抗菌活性表现为协同作用的占55.6％,相加作用占33.3％,无关作用占11.1％,不存在拮抗作用;与左氧氟沙星联用后对黏菌素异质性耐药鲍曼不动杆菌的联合抗菌活性表现为协同作用的占55.6％,相加作用占22.2％,无关作用占22.2％,不存在拮抗作用;与磷霉素联用后对黏菌素异质性耐药鲍曼不动杆菌的联合抗菌活性表现为协同作用的占77.8％,相加作用占22.2％,不存在无关和拮抗作用.结论 黏菌素与美罗培南、左氧氟沙星或磷霉素联用对黏菌素异质性耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性主要表现为协同和相加作用,与美罗培南或左氧氟沙星联用的抗菌活性较少表现为无关作用,均无拮抗作用.

摘要：目的 运用优化的汞离子特异性寡核苷酸探针（mercury-specific oligonucleotide,MSO）和氧化石墨烯（graphene oxide,GO）,构建一种超高灵敏度荧光检测水中Hg2＋的纳米生物传感器.方法 将自主设计的MSO1（5＇端进行荧光基团FAM标记,标记为FAM-MSO1）和MSO2通过非共价键作用力吸附到GO的表面,实现纳米生物传感器的组装；利用特异错配结合（T-Hg2＋-T）和溶液中荧光信号的变化情况,进行Hg2＋的定量分析.结果 制备的GO厚度仅为1.4 nm;构建的Hg2＋纳米生物传感器,FAM-MSO1和MSO2的最佳浓度均为1μmol/L,0.5 g/L GO最佳用量为5μl,最低检测限为10 pmol/L,与除Hg2＋以外的其他10种金属离子交叉反应低,加入Na2S2O3再检测Hg2＋荧光恢复效率达65％.结论 基于MSO/GO的Hg2＋纳米生物传感器,具有操作简便、灵敏、特异、准确和可重复使用性等优点,可用于水中痕量Hg2＋的检测.

摘要：目的设计基于纳米荧光素酶(Nluc)的新型荧光报告系统,构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN,分析该噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性的能力。方法构建P_(furAma)启动子控制表达的Nluc荧光报告系统,将其整合至耻垢分枝杆菌基因组中,测试其在分枝杆菌的荧光报告能力;随后将P_(furAma)-nluc报告系统整合到TM4分枝杆菌噬菌体基因组中,构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN;通过调整药物预处理时间、感染时间等条件,建立ΦFN检测分枝杆菌耐药性的快速检测流程,在96孔板中检测52株已知耐药性的结核分枝杆菌临床分离株对3种一线抗结核药物耐药的耐药性。结果整合型表达荧光报告系统P_(furAma)-nluc的耻垢分枝杆菌可报告下限达到100菌落形成单位(colony-forming unit,CFU),低于已报道的P_(left)启动子表达nluc系统。新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN可通过孔板读值法在24 h内检测到分枝杆菌的存在,检测下限达到100 CFU。药物与待测菌预培养48 h后再加入噬菌体孵育24 h,敏感菌在105 CFU以下均无法检测到荧光信号,可有效区分敏感株并进行耐药性的快速检测。以罗氏药敏实验作为金标准,使用ΦFN检测52株结核分枝杆菌临床菌株对利福平、异烟肼和链霉素的耐药性,检测准确性分别是51/52、48/52、49/52。结论利用新型重组荧光报告噬菌体检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素的耐药性具有极高的准确性,报告时间仅需3 d,有望成为一种快速简便的结核分枝杆菌耐药性检测新方法。

摘要：目的基于多重聚合酶链式反应(PCR)与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)联用的高通量检测技术,构建不同菌种的特征性单核苷酸多态性图谱以建立血流感染病原菌快速、准确、高灵敏的诊断方法。方法选取血流感染常见的大肠埃希菌等7种病原菌作为检测对象,优化多重PCR条件,采用MALDI-TOF MS检测各目标菌特征峰,建立多重PCR联合质谱检测体系;分别设计普通引物对及中部同序引物对,分析引物二聚体的形成情况;采用模拟的细菌感染血液样本,测定上述建立体系的特异度及灵敏度;收集2020年6—9月解放军总医院检验科疑似菌血症患者血液样本150份,并将上述体系的鉴定结果与临床应用的传统鉴定方法结果使用χ²检验进行比较。结果本研究设计的中部同序引物对的引物二聚体循环阈值(Ct)值在38以上,比普通引物对延迟出现6~10个循环;建立的联合质谱检测体系可同时检测分为两组的7种细菌,目标菌均可检测到特异的产物峰,除目标菌外的临床菌株只有引物峰,所有图谱无非特异的杂峰;大肠埃希菌的灵敏度可以达到50 CFU/ml,其余各菌的检测限为100 CFU/ml;对150例患者的血液样本进行检测,传统方法鉴定出阳性46例,阳性检出率为30.67%(46/150),包括2例混合感染,联合质谱方法鉴定出阳性48例,阳性检出率为32.0%(48/150),包括3例混合感染;阴性符合率为100%(101/101),核酸质谱敏感度为97.82%(45/46),特异度为97.11%(101/104),一致性检验Kappa=0.938(P=0.625),2种方法检测一致性良好。结论所建立的检测体系不仅能快速、准确地鉴定引起血流感染的7种常见病原菌,有效缩短传统培养鉴定所需时间,还可检测多重细菌混合感染,弥补混合感染漏检可能。该方法也可用于其他病原菌的鉴定。

摘要：目的联合聚合酶链反应与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术,构建检测5种临床常见念珠菌血症病原菌的高通量检测方法。方法方法学建立。以白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌为目标菌株,以内转录间隔区为靶基因,设计特异的单碱基延伸引物,在同一反应体系内进行单碱基延伸反应,用MALDI-TOF MS检测各目的菌特征峰;使用模拟血流感染样本验证上述构建的检测体系敏感度、特异度;前瞻性收集2021年10月至2022年9月解放军总医院第一医学中心检验科108例疑似或确诊念珠菌血症患者血液样本并检测;将核酸质谱检测结果与金标准血培养方法进行比较。结果用所建立的核酸质谱检测体系同时检测5种临床常见念珠菌,各菌种均可产生特异的产物峰且各菌种之间不存在相互干扰。白色念珠菌的最低检测限可达100 CFU/ml,近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌的最低检测限可达10 CFU/ml。对108份血液样本进行检测,核酸质谱的敏感度为94.74%(36/38),特异度为97.14%(68/70),阳性预测值为92.31%(36/39),阴性预测值为98.55%(68/69),配对四格表的χ^(2)检验显示2种方法无显著差异(P>0.05),Kappa一致性检验显示2种方法一致性良好(Kappa=0.9,P<0.05)。结论成功构建了适用临床念珠菌检测的核酸质谱检测体系,方法验证结果与临床血培养具有一致性。

摘要：目的利用生物信息学方法分析Sao蛋白结构并预测B细胞抗原表位,筛选可用于疫苗设计的序列。方法以Sao蛋白的氨基酸序列为基础,利用Protparam工具分析蛋白基本理化性质,TMHMM预测跨膜区,PredictProtein在线分析蛋白二级结构,SWISS-MODEL软件模拟三级空间构象,DNASTAR分析亲(疏)水性、可塑性和表面可及性,综合使用在线ABCPred和BepiPred工具预测B细胞抗原表位,筛选能用于构建基因工程疫苗的蛋白序列。结果 Sao蛋白羧基端存在7个高度一致的重复序列以及1个LPVTG保守膜锚定基序,二级结构组分中无规卷曲比例高达74.21%,三级空间构象模拟结果与二级结构预测一致。蛋白的亲水区域、可塑性区域、表面可及性区域比例分别为76.21%、64.06%和75.04%。Sao存在多个线性抗原表位,经筛选得到两个可用于疫苗设计的蛋白序列,BLAST显示这两个序列为猪链球菌所特有,存在于2型猪链球菌9种不同的分离菌株中,同时也存在于猪链球菌致病性血清型1、2、1/2、3、7、9、14型中。结论 Sao蛋白为不稳定蛋白,亲水性强,筛选得到的两个蛋白序列抗原性强且高度保守,为猪链球菌特有序列,能够用于基因工程疫苗的构建。

摘要：新型冠状病毒肺炎(COVID-19)正在全球逐渐蔓延,对人类健康和生产生活造成了巨大的影响。目前,我国的疫情已经得到有效控制,但其他国家却呈突发增长的趋势。因此,做好我国口岸卫生检疫相关工作,是防止疫情反向输入的有效手段。卫生检验检疫学课程围绕“以生为本,强化实践,交叉融合,促进创新”的教学理念,编排教学内容,设计教学过程,以满足新时代高等学校全方位育人的重要职能及公共卫生与预防医学行业对卫生检疫专业人才的需求。

摘要：虚拟仿真技术具有真实性、互动性、多样性等特点。医学检验技术虚拟仿真平台是将医学检验技术与虚拟仿真高效、有机地进行结合,为专业理论教学与实践教学带来便利。本项目基于学校现有的教学资源与附属医院的仪器设备设计出一个集检验科、大型仪器、实验项目、诊断流程为一体的医学检验虚拟仿真平台,为培养医学检验技术专门人才提供信息平台。