摘要：目的建立基于微滴式数字PCR(dd PCR)技术定量检测血浆游离DNA(cf-DNA)含量的方法,并探讨其在结直肠癌诊疗中的应用价值。方法设计β-actin特异性引物和探针,建立dd PCR检测cf-DNA绝对定量方法,根据不同浓度标准品验证该检测方法的敏感度、线性以及重复性。该法检测68例结直肠癌患者、33例结直肠良性肿瘤患者及60例健康对照者血浆cf-DNA水平,化学发光法检测其血清CEA、CA19-9水平,分析血浆cf-DNA水平与临床病理参数及血清CEA、CA19-9水平的关系,并用ROC曲线评估其诊断效能。结果本实验所建立的dd PCR方法能够检测低至10pg/μl的微量DNA模板,检测敏感度为0.29copies/μl;且在模板浓度为10pg/μl^10ng/μl的范围内线性良好(Y=-2.34+33.17X,R2=0.999);批内CV为9.85%,批间CV为11.04%。该法检测结直肠癌组、结直肠良性肿瘤组和健康对照组血浆cf-DNA水平分别为6700(3800~9925)、3100(2300~4000)、2500(1775~4000)copies/ml,结直肠癌组血浆cf-DNA水平显著高于结直肠良性肿瘤组(P=0.000)和健康对照组(P=0.000),而结直肠良性肿瘤组与健康对照组比较,差异无统计学意义(P=0.167)。结直肠癌患者血浆cfDNA水平在不同年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移以及肿瘤浸润程度间比较,差异均无统计学意义(P均>0.05),在TNM分期间差异有统计学意义(P<0.01)。结直肠癌患者血浆cf-DNA水平与CEA(r=0.210,P=0.099)和CA19-9(r=0.125,P=0.233)无相关性。ROC曲线结果显示,以5300copies/ml为cut off值,cf-DNA诊断结直肠癌ROC曲线下面积(AUC)、敏感度、特异性分别为0.931、73.3%和98.3%,高于CEA(0.762、51.7%、95.6%)和CA19-9(0.548、45.0%、82.0%)。结论建立了一种敏感、特异的dd PCR定量检测血浆cf-DNA的方法,有助于结直肠癌的辅助诊断及预后判断。

摘要：目的建立一种可以鉴别鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌的双重物种特异性PCR(species-specific Polymerase Chain Reaction,SS-PCR)诊断方法。方法基于鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌物种特异基因NFA_41530和O3I_RS18895分别设计特异性引物,通过优化反应条件和体系,建立快速准确的双重SS-PCR。对95株鼻疽诺卡菌、13株巴西诺卡菌和42株非目标菌株进行扩增,分析该方法的特异性和灵敏度,并通过模拟痰样本验证方法的准确性,预估其在临床诊断的价值。结果鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌质检分别扩增出一条清晰且单一的目标条带,其余42株非目标菌株均未扩增,表明该方法具有很好的特异性。该方法对鼻疽诺卡菌、巴西诺卡菌的检测下限分别为1.3×10^(4)copies/μL、2.4×10^(4)copies/μL,灵敏度较高。使用20个健康人的痰液模拟痰样本,检测符合率为100%。结论基于NFA_41530和O3I_RS18895基因建立的双重SS-PCR方法特异性强、灵敏度较高,是一种可以同时鉴定鼻疽诺卡菌和巴西诺卡菌的简便、快速、可靠、经济的方法。