摘要：传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM;设计一对引物在5端各引入一个BfuⅠ位点,下游引物紧邻BfuⅠ位点引入13 bp的部分LacO序列,用该引物从pHBM2002上扩增Prrn-gfp表达盒,插入PET-23aM的NdeⅠ和XhoⅠ位点,得到定向T载体pETG。PCR扩增的目的基因通过下游引物引入7 bp剩余的LacO序列,该基因片段与BfuⅠ酶切制备的定向T载体连接、转化大肠杆菌DH10β感受态细胞,通过补加了X-gal的平板筛选蓝色重组子。质粒酶切和PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100%,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cDNA,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子。随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达。该结果表明定向T载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达。

摘要：根据GenBank中α-乙酰乳酸脱羧酶的基因序列(slaA)设计引物,以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)HU1基因组DNA为模板通过PCR扩增得到了目标基因,全长为780 bp。将该基因分别连接到大肠杆菌表达载体pET30a和毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建表达质粒pET30a-slaA和pPICZα-A-slaA,并在对应的宿主中进行了表达。结果表明,大肠杆菌和毕赤酵母的表达产物的最适温度和pH均分别为40℃和7,两者在不同pH下的稳定性也相似,只不过毕赤酵母的表达产物的热稳定性要略强于大肠杆菌的表达产物。

摘要：为了得到巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)发酵的最佳培养基,在单因子试验的基础上,应用Plackett-Burman设计法对影响芽孢产量的基本培养基组分中的关键因子进行了筛选,并进一步采用响应面分析法(RSM)对影响芽孢产量的关键因素最佳水平作了深入的研究。结果表明,影响巨大芽孢杆菌芽孢产量的关键因素是豆粕和淀粉的浓度。通过RSM的拟合和推算得到在豆粕和淀粉浓度分别为48.85和19.67 g/L时,此时模型预测发酵最佳产量为43.16×108CFU/mL,验证值为42.2×108CFU/mL,预测值与验证值之间吻合较好,比原始培养基提高了约10倍。