摘要：背景:小胶质细胞在一些神经系统疾病如帕金森病、阿尔茨海默病中有重要作用。体外原代培养是进行小胶质细胞功能研究的基础,但目前常用的一些经典培养方法存在步骤繁琐、产量过低的问题。目的:建立一种简易高产量的原代小胶质细胞体外纯化培养方法。设计:以细胞为单一样本的探索性研究。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科。材料:实验于2004-04/10在协和医院中心实验室完成,新生(出生1d)昆明小鼠10只,雄性。方法:改进的培养方法以McCarthy等的经典培养方法为基础,通过提高初次接种密度,减少细胞离心过滤过程,进行不换液的营养缺失培养等重要改进,并使用低浓度胰酶-乙二胺四乙酸消化法分离纯化小胶质细胞,经MAC-1抗体免疫化学染色标记,计算MAC-1抗原阳性细胞,观察小胶质细胞培养的产量和纯度。主要观察指标:①倒置显微镜观察小胶质细胞形态。②免疫组织化学鉴定比较两种方法下小胶质细胞纯度、激活状态。结果:经典的McCarthy培养方法小胶质细胞培养周期为20d,产量为2×105个/瓶,细胞纯度为95%～97%;改进的方法小胶质细胞培养周期为15d,产量为1×106个/瓶,得到的小胶质细胞纯度为96%～98%。与经典的McCarthy培养方法比较,改进的方法周期短,产量提高了3～10倍。两种方法培养的小胶质细胞纯度和细胞激活状态没有明显差别。结论:新方法得到的小胶质细胞纯度与激活状态均与经典方法相似,但由于其步骤简单,周期短和有效提高了培养产量,为进行小胶质细胞功能特性以及在神经修复中作用的深入研究提供了良好的方法学基础。

摘要：背景:通过入院时资料早期预测其出院时的功能结局对于了解预后、计划出院后的转归很有意义,目前关于脑卒中患者平衡功能的研究越来越受到重视,而国内缺乏关于平衡功能与出院时的功能结局的关系报道。目的:根据收集的资料预测脑卒中患者出院时的功能结局,以及它与Fugl-Meyer平衡得分、Berg平衡量表得分的相关性。设计:以患者为研究对象,多因素、多变量研究。单位:一所大学医院的康复科。对象:2002-08/2003-05同济医院康复科和神经科住院的符合入选标准的首次脑卒中患者40例。方法:将收集的脑卒中患者资料与出院时的功能结局进行单因素和多因素分析,收集的资料包括患者的病史、体格检查、入院时Fugl-Meyer平衡量表评分、Berg平衡量表评分、日常生活活动能力及功能独立性评分,出院时评定功能独立性评分作为功能结局。主要观察指标:Berg平衡量表,Fugl-Meyer平衡量表与功能独立性评定的简单相关性分析,出院时功能独立性评分影响因子的逐步回归分析。结果:简单线性相关分析提示Berg平衡量表,Fugl-Meyer平衡量表得分与入院、出院功能独立性评定得分有较强的相关性(P<0.001或P<0.05),逐步回归分析发现入院时功能独立性评定,日常生活活动能力评分,Berg平衡量表评分可以预测脑卒中患者出院时的功能结局。

摘要：背景:研究证实电磁场刺激能够促进多种骨生长因子的合成与分泌,而某些生长因子具有诱导骨髓间充质干细胞定向分化成骨的作用。目的:分析工频电磁场对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计:单一样本、区组设计,观察对比动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科。材料:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科实验室完成。①选取清洁级昆明种小鼠20只,作为实验用骨髓间充质干细胞的来源。②电磁场发生器由武汉市海军工程大学研制,能生成场强为0～100mT的连续可调的50Hz正弦波电磁场。③引物均由北京赛百胜生物工程公司合成。方法:①小鼠以颈椎脱臼法处死,取双侧股骨和胫骨,体外分离培养骨髓间充质干细胞,取第2代细胞用于实验。②不同强度电磁场刺激实验:设立阴性对照组、阳性对照组、电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组、阳性对照组均不给予电磁场刺激,但阳性对照组于传代时加入含成骨性诱导剂(含10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/LVitaminC)的培养基;电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组在细胞贴壁后分别于0.4,0.8,1.6mT场强中进行电磁场刺激,每天均连续刺激1h,5d后进行指标检测。③相同场强不同作用时间电磁场刺激实验:设立阴性对照组、电磁场1.6mT刺激15,30,60min组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组不进行电磁场刺激;电磁场1.6mT刺激15,30,60min组在1.6mT场强条件下每天分别给予15,30,60min的连续电磁场刺激,5d后进行指标检测。④RT-PCR技术检测各组细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。主要观察指标:①不同强度电磁场刺激对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。②相同场强不同作用时间电磁场刺激小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。结果:①电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,阳性对照组及电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2mRNA的表达达到最大值(57.74±0.23)%,电磁场0.4mT刺激组转化生长因子β1mRNA的表达达到最大值(126.20±0.21)%。②电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,电磁场1.6mT刺激15,30,60min组骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激60min组两种因子mRNA的表达分别达到最大值(28.06±0.11)%和(75.20±0.16)%。结论:适当强度及作用时间的工频电磁场刺激,能够明显促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。

摘要：目的:探讨JWA核酶基因转染对肺动脉平滑肌细胞表型及迁移的影响。方法:实验于2004-08/2005-04在华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸病研究室完成。质粒pLXSN为第三军医大学附属新桥医院呼吸研究所惠赠。人肺动脉平滑肌细胞(C-12521)及平滑肌细胞生长培养基2(C-22162)购自德国PromoCell公司。设计合成JWA核酶基因并构建于反转录病毒载体pLXSN上,转染体外培养的人肺动脉平滑肌细胞,经鉴定证实转染成功后,应用半定量反转录聚合酶链反应法测定细胞内JWAmRNA的表达,改良Boyden小室法测定细胞迁移情况,半定量反转录聚合酶链反应法及免疫细胞化学法检测α-SMactin表达量反映细胞表型变化。结果:转染JWA核酶基因的细胞(P-JWARZ)JWAmRNA表达量较空载体转染细胞(P-pLXSN)及未转染细胞(肺动脉平滑肌细胞)显著降低,细胞迁移率显著增加,α-SMactin表达量显著减少(JWAmRNA:0.5812±0.0455,0.7823±0.0292,0.8169±0.0289;细胞迁移:29.6±4.72,7.2±1.44,6.6±1.92;α-SMactinmRNA:0.4418±0.0202,0.4767±0.0209,0.2661±0.0119;α-SMactin蛋白:0.2211±0.0093,0.3251±0.0085,0.3200±0.0095,P<0.01)。结论:JWA核酶基因转染可抑制人肺动脉平滑肌细胞内JWA基因的表达,使细胞分化为合成表型,促进细胞迁移。

摘要：背景:功能性磁刺激具有安全、无创、无副作用等优点,目前已逐步用于中枢神经传导、疲劳恢复、骨愈合、神经疾病治疗及脑功能研究等各方面。目的:观察功能性磁刺激治疗排尿功能障碍的疗效。设计:对排尿功能障碍患者,采用经骶3神经根和膀胱区的功能性磁刺激治疗,纵向观察。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院康复医学科。对象:于2003-06/2004-06在华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科就诊的8例排尿功能障碍患者,其中有3例为腰骶椎隐性脊柱裂;4例为尿频尿急综合征,上述7例病例均经长期系统的药物治疗,效果不明显。1例为自闭症及先天性巨结肠术后。方法:对8例排尿功能障碍患者,采用Dantec公司(丹麦)生产的MagLite型磁刺激仪,经骶3神经根和膀胱区的功能性磁刺激治疗,2次/d,5d/周,4～8周1个疗程。治疗前、后采用因排尿的症状而影响生活质量评分(0～6级评分,分值越低生活质量越高)和国际下尿路综合征症状评分进行疗效评价(0～5级评分,分值越低疗效越好)。主要观察指标:①治疗前后排尿次数、平均尿量及单次最大排尿量的改变。②治疗前后生活质量评分和国际下尿路综合征症状评分的变化。结果:所有8例患者经泌尿外科明确诊断为排尿功能障碍,均接受功能性磁刺激治疗,并完成所有评定。①7例难治性尿频尿急综合征患者症状有显著改善,日排尿次数显著减少,平均排尿量增加,尿急程度减轻,其中3例达到完全康复,1例患者无效。②8例患者治疗前国际下尿路综合征症状评分的总分为273分,治疗后为52分;治疗前因排尿症状而影响生活质量的总分为44分,治疗后为11分。结论:功能性磁刺激可以部分改善难治性膀胱排尿功能障碍患者的临床症状,从而提高患者的生活质量。

摘要：背景:外周血单核细胞预激活是动脉粥样硬化形成的重要早期事件和促进因素之一,丹参酮是从传统中药丹参中提取的一种脂溶性成分,具有确切的抗动脉粥样硬化作用。目的:通过检测外周血单核细胞的黏附活性与分泌活性,分析原发性高血压患者病程早期是否存在外周血单核细胞预激活,并探讨丹参酮对体外培养条件下外周血单核细胞激活的抑制作用。设计:病例对照分析。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科与中医药研究室。对象:选取2003-01/2004-10华中科技大学同济医学院附属同济医院心血管内科收治的未经治疗或已停用降压药物2周以上的原发性高血压患者30例,男16例,女14例;平均年龄(44.6±7.4)岁;体质量指数(26.2±4.5)kg/m2;平均病程(38.5±16.9)个月;对本实验均知情同意。根据1999年WHO/ISH的高血压诊断标准,均为高血压Ⅰ～Ⅱ级。排除继发性高血压、器质性心脏病、高脂血症、糖尿病、肝肾功能障碍、感染等临床情况以及高血压所致的心、脑、肾、血管等靶器官损害。另选择30例血压正常的健康体检者作为正常对照组。人脐静脉内皮细胞(武汉大学物种保存中心);丹参酮注射液(雅安三九药业有限公司,批号020724)。方法:①入选者均抽取静脉血4.0～5.0mL,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法和塑料吸附法分离单个核细胞,37℃孵育40～60min后收集贴壁细胞即为外周血单核细胞。瑞氏染色后镜下观察细胞形态符合单核细胞特征,锥虫蓝拒染试验测定活细胞数>95%。将新鲜分离的外周血单核细胞重悬,按4×107 L-1接种到24孔培养板上,每份标本设3孔:第1孔为基础分泌孔,第2孔为血管紧张素Ⅱ刺激孔,第3孔为丹参酮预处理孔。在血管紧张素Ⅱ刺激前先将外周血单核细胞与丹参酮共同孵育30min。血管紧张素Ⅱ、丹参酮终浓度分别为1×10-8mol/L和1×10-8g/L,外周血单核细胞终浓度为2×107 L-1。37℃下置于体积分数为0.05的CO2培养箱内24h,分别收集培养上清和细胞成分。②制备外周血单核细胞悬液,密度调整至2.5×109 L-1。在24孔培养板上用含体积分数为0.1小牛血清的M199培养基培养人脐静脉内皮细胞,待细胞生长至对数增长期后,铺板汇成单层,每孔加入100μL外周血单核细胞悬液,37℃下分别孵育2,4h,去除未黏附细胞,戊二醛固定后计数黏附细胞,高倍镜下每孔计数40个视野,取其平均值。③采用双抗体夹心ELISA法和反转录-聚合酶链技术检测外周血单核细胞培养上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的浓度及其mRNA的表达水平。主要观察指标:①外周血单核细胞黏附活性的变化。②外周血单核细胞培养上清中细胞因子浓度及其mRNA的表达。结果:①孵育2,4h时外周血单核细胞与内皮细胞的黏附数,在基础状态下高血压组和正常对照组基本相似(t=1.153～1.577,P均>0.05);血管紧张素Ⅱ刺激后高血压组明显多于正常对照组(t=3.842～4.536,P均0.05)。②基础状态时,两组培养上清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6的浓度均较低(t=0.981～1.829,P均>0.05);血管紧张素Ⅱ刺激后,高血压组各细胞因子浓度均明显高于正常对照组(t=2.442～5.075,P0.05)。两组外周血单核细胞中各细胞因子mRNA的表达与浓度变化基本相似。结论:①基础状态下原发性高血压患者外周血单核细胞与内皮细胞的黏附数及各炎性细胞因子浓度和mRNA表达处于正常人群水平,经血管紧张素Ⅱ刺激后显著升高,提示原发性高血压患者病程早期外周血单核细胞处于预激活状态。②丹参酮干预可使原发性高血压患者外周血单核细胞的黏附活性与分泌活性降至正常水平,证明丹参酮能够抑制预激活的外周血单核细胞进一步激活,一定程度上可防止动脉粥样硬化的发生。

摘要：背景:阿尔茨海默病研究大多主要集中在淀粉样β蛋白和神经元死亡之间的关系,但是对白质损害研究却鲜有报道。目的:观察APP/PS1阿尔茨海默病转基因动物模型前联合病理改变特点。设计、时间及地点:以组织学改变为依据,分组对照观察,于2007-09/2008-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科实验室完成。材料:雌性转基因APP/PS1小鼠(表达人突变的PS1(M146L)基因和APP(KM670/671NL,V717I)基因,对照组老鼠选用的是没有淀粉样蛋白沉积的雌性PS1小鼠。分为年轻组(2月龄,包括8只APP/PS1,7只PS1)和老年组(24月龄,包括6只APP/PS1,7只PS1)。方法:利用刚果红和免疫组织化学方法观测该AD转基因模型脑内淀粉样改变;采用氯化金髓鞘染色方法和轴突免疫组织化学染色,利用吸光度方法对前联合轴突密度和髓鞘化程度的染色进行相对吸光度定量分析。主要观察指标:①细胞内和细胞外淀粉样β蛋白的染色。②在冠状位前联合的平均面积大小测量。③前联合处轴突密度和髓鞘化程度定量相对吸光度值。结果:在老年组APP/PS1小鼠,大量的刚果红阳性染色出现在皮质,海马以及丘脑,前联合也出现阳性染色;细胞内淀粉样β蛋白仅出现在年轻组APP/PS1的皮质结构中。在老年组PS1组小鼠,前联合的表面积大小比年轻组PS1和老年组APP/PS1组小鼠都有显著的增长。老年组包括APP/PS1和PS1组轴突的染色都有显著的下降,髓鞘化程度比年轻组有增高趋势。不同表型分析显示,轴突密度和髓鞘化程度在年轻组APP/PS1和PS1组相当;老年APP/PS1组轴突密度比PS1组有显著的下降,老年组APP/PS1小鼠髓鞘化程度与PS1无显著差别。结论:随着年龄的增长,APP/PS1阿尔茨海默病转基因小鼠模型前联合存在着轴突的丢失,髓鞘相对保持完整。淀粉样β蛋白对轴突有直接的毒性作用。

摘要：背景:腺相关病毒作为一种主要的基因工程载体,已被广泛应用。但腺相关病毒是缺陷性病毒,需要包装细胞提供E1蛋白。腺相关病毒293细胞作为重要的腺相关病毒特异性包装细胞,能反式产生E1,但腺相关病毒293细胞娇嫩,培养困难,生物学特性易发生改变。因此,有必要建立一种腺相关病毒293细胞的培养方案以满足基因工程的需要。目的:建立一种体外培养腺相关病毒293细胞的方法。设计:开放性实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科。材料:腺相关病毒293细胞株购于Stratagene公司。高糖型DMEM粉(Gibco公司),AAV Helper-Free系统三质粒(Stratagene公司)。方法:实验于2006-10/2007-04在武汉同济医院神经内科实验室完成。在体外将腺相关病毒293细胞复苏,用高糖型DMEM生长培养基培养,当细胞单层融合度达到50%时传代和冻存,并倒置显微镜下观察细胞的生长状态,记录生长曲线。荧光倒置显微镜下观察,根据腺相关病毒293细胞在共转染腺相关病毒系统三质粒后以及被腺相关病毒上清感染后能否激发出绿色荧光,鉴定其包装腺相关病毒的生物学特性。主要观察指标:①腺相关病毒293细胞形态学观察。②生长曲线。③腺相关病毒包装。结果:①倒置显微镜下显示,腺相关病毒293细胞贴壁生长良好,呈现不规则的多角形,胞浆透亮,胞核隐约可见。②生长曲线显示,细胞传代后第1天为生长适应期,2～5d为生长活跃期,6d后细胞进入生长平台期。③荧光倒置显微镜下观察到,腺相关病毒293细胞激发绿色荧光,共转染腺相关病毒系统三质粒成功。腺相关病毒293细胞被腺相关病毒上清感染后激发出绿色荧光,腺相关病毒包装成功。结论:本实验的培养方法简单有用,培养的腺相关病毒293细胞可保持良好的腺相关病毒包装功能。

摘要：背景:在脂肪干细胞的研究中,针对其体外培养时生物特性与动物年龄的关系研究较多,但与脂肪部位的关系研究较少。目的:观察比较兔不同部位脂肪干细胞在体外培养时的生长特性,为下尿路组织工程的构建提供优良的种子细胞。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2007-11/2008-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院泌外实验室完成。材料:脂肪来源于兔龄4个月的雄性新西兰大白兔1只,体质量为1.8kg。方法:戊巴比妥耳缘静脉麻醉,依次无菌取出附睾附近脂肪垫、腹膜后脂肪、颈背部脂肪,I型胶原酶酶解法分离出脂肪源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs),进行体外传代后差速贴壁培养纯化。主要观察指标:观察3个部位第5代ADSCs的形态特征和生长状态,MTT法测定不同部位细胞的倍增时间。结果:①颈背部脂肪条状分布,与血管成分位置分布鲜明;附睾附近脂肪来源较丰富,且含包膜,细胞成分污染机率较小;腹膜后脂肪周围血管较多。②传代后差速贴壁培养细胞呈铺路石样,生长分化活跃,第5代左右细胞饱满,形态为较均一的多边形。③等量脂肪情况下,附睾附近和颈背部脂肪的原代ADSCs产量较多。④颈背部和附睾附近来源ADSCs分别与腹膜后来源的ADSCs的倍增时间比较差异有显著性意义(P<0.01)。结论:用于组织工程的种子细胞选取最好为5代左右;颈背部和附睾附近脂肪组织丰富且所含ADSCs较多,生长速度快,为较佳ADSCS的来源部位。

摘要：背景:川芎嗪抑制血管内皮生长因子的表达,但对其诱导HL-60白血病细胞增殖是否有抑制效应尚需进一步实验。目的:观察川芎嗪对血管内皮生长因子诱导的白血病细胞HL-60细胞增殖的影响。设计:重复测量观察。单位:武汉科技大学医学院。材料:实验于2007-03/06在武汉科技大学医学院分子生物学实验中心完成。人白血病细胞系HL-60细胞购于上海细胞生物研究所。盐酸川芎嗪注射液为无锡市第七制药有限公司产品,批号为011014,硫酸鱼精蛋白注射液购自上海第一生化药业公司,批号为010302,免疫组化试剂盒购自博士德公司。方法:①取对数生长期人白血病细胞系HL-60细胞,加入100μg/L血管内皮生长因子,分别加入终浓度为1.5,15,150mg/L川芎嗪实验培养基,以未加川芎嗪注射液的细胞为空白对照组,只含20mg/L鱼精蛋白的细胞为阳性对照组,同时设立血管内皮生长因子对照组,细胞培养48h后,采用MTT法检测HL-60细胞的生长抑制率。②川芎嗪影响HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达实验:用终浓度为1.5,15及150mg/L川芎嗪处理HL-60细胞,24h后采用免疫组织化学法计算血管内皮生长因子蛋白阳性细胞表达率。主要观察指标:①HL-60细胞生长抑制率。②血管内皮生长因子蛋白表达情况。结果:①HL-60细胞生长抑制率:川芎嗪15,150mg/L作用血管内皮生长因子诱导的HL-60细胞吸光度值均低于血管内皮生长因子对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。②血管内皮生长因子蛋白表达情况:川芎嗪作用HL-60细胞24h后,血管内皮生长因子蛋白随川芎嗪给药浓度升高表达逐渐下调,呈一定依赖性,各川芎嗪浓度干预HL-60细胞血管内皮生长因子蛋白表达阳性细胞表达率与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.01)。结论:川芎嗪可抑制血管内皮生长因子诱导HL-60细胞的增殖,并下调血管内皮生长因子蛋白的表达。