摘要：该文从解淀粉芽孢杆菌中克隆得到木聚糖酶基因,在大肠杆菌中实现高效率的异源性表达,设计响应面实验获得最佳的表达优化条件,得到更高酶活力的产物。利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)溶液对重组菌株BA-TB-1进行诱导表达,对诱导条件进行优化。实验发现该木聚糖酶对酸具有较好的耐受性,在pH值为5.0~6.0时有较高的酶活性。在37℃,pH5.0和pH 5.0~7.0条件下分别培养1 h,测定酶活力,残余酶活性分别保持在68%和50%以上。最后通过响应面法得到最佳的优化条件,在此最优条件下进行诱导表达。预测值和实际值分别为550.139、548.87 U/mL,预测值与实际值相近,说明应用响应面法优化木聚糖酶的表达条件可行,该实验结果为大量生产酸性木聚糖酶奠定了一定的理论基础。

摘要：【背景】酚酸脱羧酶催化分解酚酸产生的4-乙烯基酚类物质可用于食品添加剂及香精香料行业,而酚酸脱羧酶的表达水平相对较低,因此,高水平的酚酸脱羧酶是工业规模生产4-乙烯基酚类物质的先决条件。【目的】克隆解淀粉芽胞杆菌的酚酸脱羧酶基因,实现在大肠杆菌中的高效异源表达,分析酚酸脱羧酶的底物特异性,并对其表达条件进行优化。【方法】通过PCR技术获得酚酸脱羧酶的基因,构建重组基因工程菌,将测序结果与其他酚酸脱羧酶序列进行比对,利用IPTG诱导方法高效表达蛋白。将重组酚酸脱羧酶与4种不同的底物进行反应,设计响应面试验对诱导条件进行优化。【结果】酚酸脱羧酶对对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸的比酶活比率为:100:23.33:15.39:10.51。结合与其他酚酸脱羧酶比对结果发现酚酸脱羧酶家族的C末端区域氨基酸序列的变异率最高,这与酚酸脱羧酶的底物特异性和催化机制有关。通过单因素和响应面试验得到酚酸脱羧酶诱导表达的最佳条件为:2×YT培养基,诱导温度30°C,接种量1.78%,诱导时机3.8 h,IPTG1.25mmol/L,诱导时间18h,此时预测酶活和实际酶活分别为47.61IU/mL和47.55IU/mL。【结论】应用响应面法优化酚酸脱羧酶的诱导表达是可行的,本试验为以后生产稳定、高产的酚酸脱羧酶以及了解其催化机理提供了重要的理论基础。