摘要：目的用基因工程生产人醛缩酶A(ALDOA),为后续酶学研究奠定基础。方法用Snapgene设计一对5′分别附加Nde I和Xho I位点的引物,PCR扩增ALDOA cDNA,cDNA与质粒pET-28a经Nde I+Xho I酶切后用琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。用DNA连接酶连接cDNA和pET-28a,连接产物转化大肠杆菌Top10,于卡那霉素的LB平板(LBK板)筛选抗性菌落。于LBK培养基培养抗性菌落,抽提质粒,酶切和测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),同法筛选抗性菌落,于LBK培养基培养抗性菌落,0.2mmol/LIPTG,16℃诱导24h。超声破碎细胞,离心取上清,用Ni^(2+)-NTA试剂盒纯化ALDOA。超滤浓缩纯化的ALDOA,用pH7.0磷酸缓冲液交换洗脱液,降低ALDOA溶液中的咪唑浓度。BCA法测定重组ALDOA浓度并保存。结果大肠杆菌表达质粒pET-28a-ALDOA构建成功,重组菌pET-28a-ALDOA-BL21(DE3)经0.2mmol/LIPTG诱导后,ALDOA获得可溶性表达,产量达600mg/L。结论高产量、高纯度的ALDOA为后续酶学研究奠定了坚实基础。

摘要：目的表达与纯化人磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1),为后续研究奠定基础。方法用SnapGene设计5′侧翼添加Nde I和Xho I位点的上、下游引物,PCR扩增cDNA,扩增产物与质粒pET-28a经Nde I和Xho I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化。用DNA ligase连接cDNA和pET-28a,热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5α,转化产物涂布于含卡那霉素(Kanamycin)的LB平板(LBK板),筛选抗性菌落。于含卡那霉素的LB培养基(LBK培养基)培养抗性菌落,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定。将重组质粒同法转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选抗性菌落。将一个抗性菌落接种于LBK培养基,37℃250r/min培养至OD约0.8。用0.1mmol/L IPTG,16℃诱导PGAM1表达20h。收集细胞,超声破碎,离心取上清,用Ni-NTA试剂盒纯化PGAM1。超滤浓缩纯化的PGAM1,并用不含咪唑的缓冲液进行交换,降低PGAM1溶液中的咪唑浓度。BCA法测定PGAM1浓度,保存PGAM。结果重组质粒pET-28a-PGAM1构建成功,基因工程菌pET-28a-PGAM1-BL21(DE3)经IPTG诱导,PGAM1获得可溶性表达,产量达120mg/L。结论高纯度、高产的PGAM1为后续研究奠定了坚实基础。