摘要：为研究fhl1a基因在心脏发育中的作用,利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼fhl1a基因.在斑马鱼fhl1a基因的三号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体.将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中以期实现对目的靶基因fhl1a的敲除.随后收集部分72 h胚胎进行PCR检测和产物直接测序,确定有无突变.为进一步验证突变是否可稳定遗传,选择具有敲除了的F_0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F_1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序分析.结果显示F_1获得了不同程度的插入、缺失等突变类型.研究结果证明所设计的fhl1a基因CRISPR/Cas9敲除系统能在斑马鱼体内有效地形成基因突变,该突变能稳定地遗传到下一代个体,这为进一步研究fhl1a基因在心脏发育中的具体调控机制打下了基础.

摘要：为构建一个针对TCF25(transcription factor 25)基因的慢病毒干扰载体,设计并合成3组针对TCF25的短发夹RNA序列(shRNA),通过基因重组技术连入p LL3.7载体,酶切鉴定及DNA测序后,重组正确的p LL3.7质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞,培养48 h后,分别收集细胞培养上清液,感染H9C2细胞,Western-blot检测TCF25在H9C2细胞中的表达.结果显示TCF25蛋白在H9C2细胞中的表达被抑制.这说明TCF25的慢病毒干扰载体构建成功.

摘要：研究工作者们一直致力于寻找一种在模式生物中进行精确基因修饰的方法。近期基于TALENs的基因打靶方法受到广泛的注意,并在包括果蝇、斑马鱼、小鼠及人类多潜能细胞的多物种中取得成功。在这里,我主要介绍基于TALENs的基因修饰在果蝇模型中的应用以及果蝇心脏发育候选基因Yippee的敲除。首先,我们设计并拼接好了Yippee基因的TALENs靶位点序列,连接在核酸酶Xmn I的催化区域。在核酸酶的作用下产生双链的断裂,随后在非同源末端连接物修复系统(NHEJ)的修复下导致Yippee基因的消除或部分缺失。经过检测,得到Yippee基因的TALENs打靶效率约为9%。

摘要：已有研究表明RMND5B可能与心肌肥大相关,但具体机制不明,RMND5B的重组腺病毒载体的构建和鉴定为研究RMND5B功能提供了基础工具。首先,设计小鼠RMND5B基因的特异性引物,以c DNA为模板,PCR扩增RMND5B ORF区,并在两端各加入HindⅢ及SalⅠ的酶切位点。将此片段插入到p MD18-T载体,再亚克隆至线性化的穿梭质粒p Ad Track-CMV中。PmeⅠ酶切线性化之后,电转化到含p Ad Easy-1的BJ5183感受态细菌中。在BJ5183细菌中发生同源重组获得了重组质粒p Ad-RMND5B质粒。PacⅠ酶切线性化之后转染293A细胞,经过包装获得腺病毒AdRMND5B。将此腺病毒感染新生大鼠原代心肌细胞,并在一段时间后观察绿色荧光并通过RT-PCR检测RMND5B的表达情况。结果表明,成功构建了RMND5B的重组腺病毒载体并实现了AdRMND5B在新生大鼠原代心肌细胞中表达,为进一步研究RMND5B基因在心肌肥大中的作用奠定了良好的实验基础。

摘要：Kruppel在果蝇发育过程中起着重要的调控作用。为了进一步研究Kruppel的功能,需要制备Kruppel蛋白及其抗体.对已有的Kruppel序列进行分析,选取适当区域进行引物设计,从果蝇心脏cDNA文库中PCR扩增得到Kruppel部分编码区序列,并其连接到pET-28a载体上。将重组质粒(pET-28a-Kruppel)转化rosetta受体菌,通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导表达融合蛋白,用镍柱进行亲和纯化。将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体的效价。

摘要：设计小鼠Txt5基因的特异性引物,将小鼠c DNA作为模板,用PCR扩增出m Txt5编码区,并加入HA标签序列.将这一片段插入p MD-18T载体,再亚克隆至p Adtrack-cmv穿梭载体上.线性化后,转化BJ5183感受态细胞,在BJ5183中发生同源重组获得p Ad-Txt5质粒.p Ad-Txt5线性化后转染293A细胞,包装得到含Txt5基因的病毒.将病毒溶液感染大鼠原代心肌细胞,一段时间后观察绿色荧光,然后通过RT-PCR和免疫印迹法检测HA标签蛋白的表达.结果表明成功构建小鼠Txt5腺病毒表达载体并实现在大鼠原代心肌细胞中的表达.

摘要：为进一步研究延长因子-1(elongation factor-1α,EF-1α)在调控心脏发育和果蝇心脏功能中发挥的作用,制备延长因子-1的抗体.利用生物信息学选择果蝇EF-1α基因抗原亲水区,并设计出特异性引物,PCR扩增出的片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入***中后通过IPTG诱导融合蛋白表达,将His-EF-1α融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,再用Western Blot检测抗体的效价和特异性.研究结果表明,获得了EF-1α原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗EF-1α多克隆抗体.EF-1α多克隆抗体的效价可以达到1比1500,并且有很强的特异性,为后续研究EF-1α基因在心脏发育和心脏功能中的作用奠定了基础.

摘要：目的:构建含有小鼠Lrrc10(Leucine-rich Repeat Containing protein10)基因的重组腺病毒表达载体。方法:设计小鼠Lrrc10特异性引物,以小鼠cDNA为模板,通过PCR扩增出mLrrc10的编码区,并引入HA标签蛋白和SalΙ酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18T载体。测序后,用SalΙ和Hind III酶切,将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用PmeΙ线性化后,用100 ng转化细菌BJ5183,在细菌内同源重组后得到pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM 2000转染293A细胞,包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后,反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞,绿色荧光观察GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果:用病毒液感染原代心肌细胞,24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光,提取心肌细胞总蛋白,Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论:小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功,并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。