摘要：目的建立儿童新发呼吸道病毒的多重实时荧光定量PCR检测方法，并利用该方法进行临床标本的检测。方法根据人类偏肺病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、人博卡病毒、KI多瘤病毒和wu多瘤病毒的保守区域设计并合成引物和探针，确定引物和探针的特异性，优化引物和探针的组合浓度，通过检测具有类似临床症状的其他病原体的标本评价该多重荧光定量PCR方法的特异性，构建质粒标准品用于分析检测该方法的灵敏度和重复性；并对2009至2012年湖州市妇幼保健院及湖州市中心医院收集的322例呼吸道感染患儿的痰液标本进行检测分析。结果成功建立了这6种新发呼吸道病毒的多重荧光定量PCR检测方法，能够同时或分别对其进行检测。体系中筛选的引物和探针具有很好的特异性，并优化出适合的引物探针组合浓度，灵敏度分析最低检测限为10拷贝数／μl，重复性分析中批内变异系数（CV）为1．2％～3．4％，批间CV为0．08％～0．85％，均小于5％。322份临床标本中，人类偏肺病毒阳性17份，阳性率5．28％，人博卡病毒9份，阳性率2．80％，未检到冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒。结论多重荧光定量PCR方法具有简单快速，灵敏性和特异度高等特点，并且能实现多种新发病毒同时并行检测，可为儿童呼吸道新发病毒感染的临床诊治提供技术支持。

摘要：目的建立快速、准确、特异的检测WU多瘤病毒的实时荧光聚合酶链反应方法。方法根据TaqMan探针技术荧光定量PCR原理，以WU多瘤病毒VP2基因为靶序列，设计并合成引物和荧光探针；优化PCR反应条件，评价实时荧光PCR方法的特异性、灵敏度、重复性；并对394例临床样本进行检测。结果成功建立了WU多瘤病毒的荧光定量PCR检测方法；该试验所建立的实时荧光PCR方法可准确、特异的检测WU多瘤病毒；该方法可定量检测1．0×10^0～1．0×10^7拷贝范围的wu多瘤病毒；检测的批间和批内的变异系数均〈5．0％；394例患儿痰标本中共检测出3例人WU多瘤病毒阳性，阳性率为0．76％。结论所建立的WU多瘤病毒荧光定量PCR法敏感性较高，重复性、特异性良好，适合于临床标本检测及大样本量筛查，可为临床诊断及流行病学研究奠定方法学基础。

摘要：目的建立导流杂交芯片技术检测粪便标本中8种肠道致病菌。方法以细菌16S rDNA和23S rDNA序列设计通用引物和寡核苷酸探针,将活性氨基标记的探针依次固定在BiodyneC膜上,制成检测芯片,用标记生物素的引物进行PCR扩增,将扩增产物与检测芯片在核酸分子快速杂交仪上进行杂交,以POD和TMB进行显色,判断结果;应用该方法检测8种肠道致病菌标准菌株和120份腹泻患者粪便标本,通过细菌培养结果比较该方法的有效性。结果120份临床粪便标本中,采用导流杂交芯片共检出68份(56.67%)携带肠道致病菌;细菌培养鉴定出63份(52.50%)携带肠道致病菌,其中58份导流杂交芯片与细菌培养结果一致,准确率为85.29%。结论导流杂交芯片技术能够快速准确检测8种常见肠道致病菌,而且适用于流行病学调查研究。

摘要：目的:建立快速检测和甄别铜绿假单胞菌死活状态的定量方法。方法:根据铜绿假单胞菌gyrB基因序列设计引物和探针;提取铜绿假单胞菌菌体总RNA,采用一步法逆转录实时荧光定量PCR反应液对其进行检测。评价逆转录实时荧光定量PCR方法的特异性和敏感性,对收集的临床病人样本和模拟样本进行检测。结果:本试验建立的逆转录实时荧光定量PCR方法能特异、准确、快速的鉴定铜绿假单胞菌菌体死活状态,敏感度达102cfu/m l。临床标本检测结果与细菌培养结果具有较高一致性。10份模拟样本鉴定结果也完全一致。结论:一步法逆转录实时荧光PCR方法能够有效快速检测铜绿假单胞菌,并能甄别死活状态。

摘要：噬菌体是病毒的一种,广泛存在于土壤植物、水、动物和人体中。其特别之处是专以细菌为宿主,能够裂解细菌,可以看作是细菌的自然天敌,对真核生物不具有侵袭性,因而噬菌体疗法被认为对人体是安全的。目前也有多个临床研究证明其安全性,有些已经到达了临床Ⅱ期[1]。噬菌体最早由英国的Twort在葡萄球菌中发现,之后被法籍-加拿大微生物学家d'Herelle再次发现并命名为噬菌体。噬菌体体积微小,比细菌还小很多,只有在电镜下才能被观察到。噬菌体种类繁多,自然界每种细菌都有其对应的噬菌体。同时它结构简单,没有完整的细胞结构,以T2噬菌体为例,包括头部和尾部,头部呈正20面体,包括蛋白质的外壳和内部折叠的核酸分子;尾部由蛋白质外壳组成中空的长管状结构,外面包有可收缩的尾鞘。被发现后不久,噬菌体就被用来治疗细菌感染,称为噬菌体疗法。1919年在巴黎首次将该疗法用于治疗患细菌性痢疾的患者,受到广泛的关注,随后于与之相关的多种商用噬菌体制剂问世。然而随着抗生素的发现和应用,欧美等国家逐渐放弃对其的研究,仅仅前苏联和东欧一些国家仍然坚持对其进行研究。然而这些研究的设计往往是有缺陷的,甚至没有安慰剂和对照组,因而其结果的可信性不高。[2]随着超级细菌的出现和抗生素的治疗无力,医疗界迫切需要新的防治措施,这种昔日的疗法,即噬菌体疗法的在全球呈复兴趋势,与之相关的研究越来也多[3]。同时噬菌体细菌检测和细菌耐药性检测等方面也有着应用。