摘要：根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物,构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验,成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染后的猪肺组织中NLRP3表达水平。最佳引物浓度为0.15μmol/L,建立的标准曲线方程为y=-3.5196x+36.968,E值为0.96,最低检测量为84个拷贝,熔解曲线有单一峰,批内变异系数CV为0.067%~0.184%,批间变异系数为0.221%~0.594%,重复性好。该方法检测仔猪在感染Mhp后肺组织中的NLRP3 mRNA表达水平,感染组与健康组相比差异显著(P<0.01),NLRP3表达水平明显增高,在感染后14 d可达到高峰,平均mRNA拷贝数达18000左右,可持续42 d。表明该检测方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的激活及其相关炎症反应机制提供了技术支持。

摘要：为研究魏氏梭菌β毒素蛋白在机体免疫应答中的作用和特点,参照GenBank:中KP064405.1B型魏氏梭菌β毒素基因,使用Primer5.0软件,设计合成了一对引物,应用PCR方法扩增出长为756bp的β毒素主要抗原区域,将该基因克隆到原核表达质粒pET 32a(+)中,经酶切鉴定、测序分析后,转化大肠杆菌BL21,并对其诱导表达。大肠杆菌表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白约为45KD,主要以包涵体形式存在。