摘要：本研究根据GenBank中已有的虾肝肠胞虫(EHP)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)基因的保守序列,设计特异的引物和探针。建立了快速诊断EHP和SHIV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测。结果表明:该方法检测限可达10 copies/μL,其敏感性是SYBR Green real-time PCR的10倍,普通PCR法的100倍;对白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、高致病性副溶血弧菌,以及桃拉综合征病毒的检测结果均为阴性,表明无交叉反应,具有良好特异性;重复性试验结果表明,该方法Ct值的变异系数小于4%,具有良好的稳定性。对37份已知检测结果的样品进行检测,结果符合率为100%。本研究建立的EHP和SHIV检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对虾隐性感染的早期监测。

摘要：近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)流行区域不断扩大,已经成为我国南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖重要病原之一。本研究根据Gen Bank中虾肝肠胞虫18S r RNA保守区域设计一套特异性引物和荧光探针,通过优化反应条件,建立检测EHP的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法。建立的方法呈良好的线性关系(R~2=0.998),灵敏度是巢式PCR的10倍。特异性试验表明:检测其他常见病原均为阴性,特异性好;重复性试验显示:批内批间变异系数均小于1.5%,重复性良好;对临床样品检测,与巢式PCR的符合率为97.81%。使用该方法对中山市、江门市和珠海市珠三角部分地区南美白对虾开展EHP流行病学调查,其中虾苗检出率为10.75%,成虾检出率为54.07%,部分区域检出率较高,要防范爆发风险。本研究建立的实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性和重复性良好,具有较好的应用前景。

摘要：为建立蓝舌病病毒8型(BTV-8)的快速检测方法,本实验根据GenBank中BTV-8 VP2基因保守序列,设计并合成特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立BTV-8实时荧光重组酶介导扩增(RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法仅对BTV-8呈阳性反应,对BTV其他血清型、小反刍兽疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、伪狂犬病病毒和口蹄疫病毒均为阴性结果,特异性强;对重组质粒标准品的最低检测限为20拷贝/μL,敏感性与已报道的BTV-8荧光定量RT-PCR检测方法相同;批内和批间变异系数均小于5%,重复性好。对146份临床血清样品和4份盲样进行检测,结果与已报道的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致,其中1份盲样检测结果为阳性其余样品均为阴性,二者符合率达100%。本研究建立的BTV-8实时荧光RT-RAA检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速、稳定性好的优点,可以应用于蓝舌病流行病学调查和BTV感染的早期监测。

摘要：为建立传染性脾肾坏死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)的定量快速检测方法,根据GenBank中的ISKNV衣壳蛋白(MCP)编码基因保守序列设计一对特异性引物和探针,建立了ISKNV TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示:以重组质粒标准品构建的标准曲线相关系数为0.997,具有良好的线性关系;检测下限为10 copies/μL,敏感性是常规PCR的10倍;对传染性造血器官坏死病毒、病毒性神经坏死病毒、黄颡鱼杯状病毒、大口黑鲈虹彩病毒、鳜鱼弹状病毒的检测结果均为阴性,仅ISKNV检测结果为阳性;批次内和批次间的变异系数均小于2%。应用建立的方法对已知结果的233份临床样品进行检测,检出76份阳性、157份阴性,与已知结果一致。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有敏感、快速、特异以及可定量、重复性好等优点,可用于ISKNV感染的快速鉴别诊断、定量检测以及分子流行病学调查。