摘要：牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病。丙酮酸脱氢酶复合体E1(pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。本研究参照Gen Bank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα(Gen Bank登录号:KU355295)及pdhβ基因(Gen Bank登录号:KU355296),在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术完成基因优化并构建原核表达质粒p ET-pdhα和p ET-pdhβ。表达质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组PDHc E1α亚基融合蛋白PDHA及PDHc E1β亚基蛋白PDHB。纯化表达产物并分别免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对M.b PDHc E1α亚基和PDHc E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究。结果表明,经IPTG的诱导,pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均成功表达,重组蛋白r PDHA及r PDHB的分子量分别约为40和37 k D,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA结果证实E1α和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当。本研究结果为进一步研究M.b生物学功能提供了基础资料。

摘要：双峰驼(Camelus bactrianus)作为西北地区的濒危物种,其生理特性特殊,用途广泛。利用诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)对该物种的种质资源进行保护具有重要的应用价值。但传统分离鉴定iPSCs的方法较为复杂繁琐。为了对iPSCs进行快速高效的分离鉴定,本实验利用CRISPR/Cas9系统,参照双峰驼Nanog基因,在其终止密码子附近设计单链导向RNA (single guide RNA,sgRNA),成功构建了切割载体;以双峰驼全基因组为模板获得上、下游同源臂,并在两个同源臂之间连入两个报告基因绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein, GFP)和新霉素抗性基因(neomycin resistance,Neo),成功构建了表达载体。同时测得双峰驼胎儿成纤维细胞对于遗传霉素(geneticin, G418)的最小致死量。用表达载体与切割载体共转染双峰驼胎儿成纤维细胞,继续培养48 h后,用G418筛选两周;之后用不含G418的DMEM/F12完全培养基对药筛后的细胞进行扩大培养,成功获得了活力较高的稳定转染细胞系。本实验为验证在Nanog基因后定点敲入报告基因来正确筛选iPSCs提供了生物材料。

摘要：目的为能够用实时荧光定量PCR研究消化系统PrP mRNA的表达水平,构建目的基因PrP的标准品质粒和标准曲线。方法根据GenBank中绵羊基因编码区保守序列,设计特异性引物和分子信标探针;提取总RNA,经反转录、RT-PCR后,提取质粒,PCR-SSCP及测序鉴定,获得ARQ质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果结果显示,本实验设计的分子信标具有特异性强、灵敏度高和结果准确的特性;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因的标准品质粒和标准曲线。

摘要：旨在对甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要致病菌进行分离鉴定并建立一种病原菌多重PCR(multiplex polymerase chain reaction,MPCR)检测方法。根据病原菌分离鉴定结果,选取主要致病菌金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus,***)、大肠杆菌(Escherichia coli,***)和马链球菌(Streptococcus equi,***)进行多重PCR检测方法的建立。提取3种标准菌株基因组并基于nuc、phoA、fneB的保守区域设计3对特异性引物,扩增预期核酸片段分别为1319,385,109 bp,进行引物特异性MPCR验证同时对扩增条件中的退火温度、引物浓度优化,建立检测3种病原菌的多重PCR,完成样品检测评估。结果表明,山丹地区马子宫内膜炎主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌,设计的引物与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,***)、肺炎链球菌(Pneumococcus)无交叉反应,建立的多重PCR检测方法退火温度在59.4℃时最佳;在引物为0.3~1.0μL优化区间内,***、***和***引物最佳用量分别为0.5,0.5,1.0μL,临床样品检测结果与病原菌分离鉴定结果一致。本研究成功分离鉴定了甘肃省山丹地区马子宫内膜炎的主要病原菌并建立多重PCR检测方法,为马子宫内膜炎的快速诊断和防控提供了技术支持。

摘要：为研究红茂草(Dicranostigma leptodum(Maxim.)Fedde)生物碱的正交提取工艺条件及其清除自由基作用。采用单因素水平测定,从10种相关因素中筛选出乙醇体积分数、超声波作用时间、液料比、回流时间、浸提液pH值、浸泡时间共6种主要影响因素,按照L25(56)正交表进行正交试验,用SPSS 17.0软件进行统计分析,优选出最佳正交提取工艺模式;将正交提取浓缩液进行HPLC检测,并测定其对羟自由基(.OH)和氧自由基(O2.-)的清除作用。结果表明:红茂草生物碱最佳提取工艺条件为乙醇体积分数65%、超声波作用时间20min、液料比15∶1、回流时间2.5h、浸提液pH=8、浸泡时间4h;在最佳提取工艺条件下红茂草提取液中生物碱的含量为9.2794%;红茂草生物碱在25.0和***-1时,对.OH和O2.-清除效果显著,其清除率为58.70%和49.26%,IC50为23.50和***-1。该工艺方法简便、可靠、提取率高,提取液清除自由基作用显著。

摘要：根据大肠杆菌的β葡糖醛酸酶基因(uid)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc),分别设计3对特异性引物,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性以及扩增条件进行优化.结果表明:3对引物分别能扩增出147bp、570bp和280bp的特异性条带,反应条件优化后,3种目的菌在104 CFU/mL时均可同时扩增出较清晰条带(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在103 CFU/ml浓度下仍然可见到条带),仅沙门氏菌的检测比单基因PCR低一个稀释度,人工模拟果汁污染试验结果稳定.该方法操作简单、快速、特异性强,灵敏度高,能够实现对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种菌的快速诊断检测和生产过程监控.

摘要：将新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)感染健康鸭胚,采用尿囊液方法提取总RNA,根据GenBank已发表的新城疫病毒HN基因序列设计一对引物,以一株鸭源NDV的总RNA为模板,经RT-PCR扩增出约1.7kb的HN基因片段.将其克隆到原核表达载体pET-30a,获得重组质粒pET-HN后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.重组菌经IPTG诱导表达后,裂解产物进行SDS-PAGE分析,结果发现在约64ku处可见预期条带.Western-blot结果表明:表达的HN蛋白可与NDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性,本结果为鸭源NDV抗体检测提供了理论依据.

摘要：为调查甘肃省兔艾美耳球虫的感染状况、虫种分布和风险因素,本研究从甘肃省平凉、酒泉、武威地区采集5个不同品种兔的592份粪便样品,提取粪便样品中的基因组DNA,基于艾美耳球虫核糖体第1内转录间隔区(ITS1)设计引物,采用特异性PCR扩增兔艾美耳球虫基因片段。结果发现,兔艾美耳球虫的总感染率为50%(296/592);通过序列比对分析共鉴定出7种不同的兔艾美耳球虫,分别是大型艾美耳球虫(24.5%,145/592)、肠艾美耳球虫(4.1%,24/592)、中型艾美耳球虫(11.5%,68/592)、穿孔艾美耳球虫(19.8%,117/592)、维氏艾美耳球虫(24.5%,145/592)、小型艾美耳球虫(4.9%,29/592)和盲肠艾美耳球虫(0.84%,5/592);以大型艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫为优势虫种,同时发现所调查的兔中有多重感染的情况,最多包括四重感染。统计学分析显示,地区因素(P<0.05)、品种因素(P<0.05)和年龄因素(P<0.05)是影响兔艾美耳球虫感染率的风险因素,提示应该针对这3种因素采取有效的防控措施。本研究结果揭示了甘肃省部分地区养殖场兔的艾美耳球虫感染率、虫种分布和感染率的风险因素,为预防和控制甘肃省地区养殖兔的艾美耳球虫病提供了科学依据。

摘要：本实验旨在研究湖羊、夏澳湖、夏杜湖羔羊6月龄的生长发育状况。选择1日龄健康羔羊90只,采用3×2两因子随机试验设计,每个处理15只羔羊,试验期为180 d。结果表明:通过主效应(品种、性别)分析发现,夏澳湖、夏杜湖羔羊180 d的体重、胸围、体长、管围以及0~180 d的体重、体高、体长和胸围绝对生长均显著高于湖羊;同时,180 d的公羔体重、体高、体长、胸围、管围均显著高于母羔;通过品种和性别互作分析发现,夏澳湖、夏杜湖公羔180 d体重、体长、胸围、管围均显著高于湖羊公羔和母羔。同时,夏澳湖和夏杜湖母羔的胸围显著高于湖羊公羔和母羔,且其体重、体长显著高于湖羊母羔。同时,其在180 d的体重以及0~180 d体重的绝对生长、体长、管围上能达到湖羊公羔水平;胸围与体重两者之间呈现最高正相关。综上所述,三元杂交与纯种湖羊相比,生长发育方面有更大的优势。

摘要：为获取猪源NF-k B受体激活因子配体(RANKL)及其抗体,根据GenBank中猪源RANKL的序列设计引物,将合成的RANKL基因克隆至pMAL-C4x表达载体,转化到大肠杆菌DH5α。经PCR和双酶切鉴定后测序分析,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21后通过IPTG诱导表达。优化表达条件,确定是包涵体表达,蛋白大小为78.1 ku。使用纯化的RANKL为抗原免疫兔制备多克隆抗体。构建重组质粒pCMV-RANKL,表达目的蛋白并使其与多克隆血清反应。经ELISA、Western-blot和IFA鉴定,证实抗RANKL多克隆抗体有良好的抗原特异性,为后续黏膜免疫的研究奠定了基础。