摘要：目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体。检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高。以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为(48.93±3.86)ng/mL。结论:本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFPHIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部。

摘要：目的 :针对传统骨性关节炎模型建立时存在的固定动物花费时间长、动物挣扎剧烈、单人操作困难、低温装置控温难等问题,设计一种操作安全且简便的鼠骨性关节炎低温造模装置。方法:该装置由控温箱和鼠固定器组成,主要制作材料为有机玻璃和金属。其中控温箱主要由卡位条和温度显示屏组成,用于安装鼠固定器和显示温度变化;鼠固定器主要由固定底板、防护罩、第一挡板和第二挡板组成。采用该装置对3月龄BALB/c雄性小鼠进行30 d的低温处理,观察小鼠的后肢形态、关节肿胀度、血清学指标和踝关节病理切片等,验证该装置建立小鼠骨性关节炎模型的可行性。结果:采用该装置可在1 min内完成单只小鼠的固定,且5~6℃低温可稳定维持3 h,整个造模过程小鼠挣扎程度小,操作者未出现任何抓伤或咬伤;小鼠后肢形态、关节肿胀度、血清学指标和踝关节病理切片结果表明,该装置可成功建立鼠骨性关节炎模型。结论:该装置操作简便、安全可靠、低温条件稳定、省时省力,可用于建立小鼠骨性关节炎模型。

摘要：1生物合成新技术概述合成生物学将工程设计原则合理地应用于分子生物学、新的基因装置设计,在疾病的诊断和治疗的领域发挥作用[1],如,创建全细胞生物传感器[2],基因修饰益生菌[3]以及细胞生物分子加工厂。源自基因工程的生产细胞系基础上,生物合成已成为药品生产[4]、蛋白质疗法[5]、燃料及其他产品[6]的主流技术。

摘要：目的 构建同时携带白细胞介素2（IL-2）和NK4基因的真核表达载体（pIRES-IL-2-IRES-NK4）,观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景.

摘要：目的构建人钙整合素结合蛋白1(calcium-and integrin-binding protein 1,CIB1)基因RNA干扰慢病毒载体,获得稳定下调CIB1表达的慢病毒。方法根据CIB1的序列,设计siRNA序列,克隆入慢病毒核心质粒pGV112中,并与辅助质粒一起转染293T细胞进行病毒包装,用慢病毒感染293T细胞并测定病毒滴度。以CIB1干扰慢病毒感染人胶质瘤细胞SHG44后,应用Western blotting方法检测CIB1的表达。结果成功构建CIB1干扰慢病毒载体,包装后获得慢病毒颗粒,病毒滴度检测可达6×108pfu/ml,感染细胞CIB1蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。结论成功构建人CIB1基因RNA干扰慢病毒,为后续CIB1生物学功能研究奠定基础。

摘要：目的:构建同时携带低氧诱导因子-lα(HIF-lα)和角质细胞生长因子(KGF)的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF-KGF),观察其在防治肺损伤潜在的应用前景。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1αcDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP-HIF。然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmeI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle-GFP-HIF-KGF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF。检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高。用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100 MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48h ELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为(56.36±4.53)ng/mL,KGF蛋白表达水平为(60.20±2.92)ng/mL。结论:成功构建了腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础。

摘要：研究显示骨髓和外周血来源的内皮祖细胞(EPCs)参与肿瘤新生血管生成,并与肿瘤的生长、转移、预后密切相关。最近研究发现卵巢癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤患者外周血中EPCs升高。外周血EPCs作为一个新的生物标志物在肿瘤的诊断、治疗方案的设计、评估肿瘤预后方面有很大的潜力。全文就EPCs在肿瘤新生血管生成中的重要作用以及EPCs是否可以作为肿瘤标志物应用于肿瘤治疗预后判断作一综述。

摘要：目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能。方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定。通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒载体pGsadeno-Notch1-shRNA。经Pac I线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒。产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质干细胞,RT-PCR和Western blot检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果。结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确。重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3 d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平。对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31%和86.97%,具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础。