摘要：目的克隆、表达日本血吸虫2种酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的全长基因．并研究这2种基因在日本血吸虫不同性别和不同发育阶段的转录特异性。方法设计特异性引物，从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出SjTYR1和SjTYR2的全长片段，并克隆人原核表达载体pSJ2，验证正确的重组质粒转化大肠埃希菌（***）Rosetta Gami细胞，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并用组氨酸标签对表达产物进行亲和层析纯化。将纯化后获得的重组蛋白SjTYR1和SjTYR2分别免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。分别以重组蛋白免疫兔血清和日本血吸虫感染兔血清为一抗，用蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性和免疫反应性；以重组蛋白免疫兔血清为一抗．用Westernblotting观察其与日本血吸虫虫体蛋白的反应情况。制备感染后14、16、18、20、22、24、26和28d雌虫和雄虫的总RNA，利用RT-PCR分析SjTYR1和SjTYR2基因在日本血吸虫不同性别及不同发育时间的转录水平的差异。结果构建了重组原核表达载体SjTYR11/pSJ2和SjTYR2／pSJ2，诱导后获得包涵体形式表达的重组蛋白，相对分子质量（尬）分别为55000和56800，与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白SjTYR1可被日本血吸虫感染兔血清识别，而SjTYR2则不能。rSjTYR1免疫兔血清与虫体蛋白反应后，可见一条约M100000的条带，rSjTYR2免疫兔血清不与虫体蛋白反应。在雄虫体内，2种酪氨酸酶均不转录；在雌虫体内，2种酪氨酸酶在感染后24d内不转录，自24d开始出现激增，之后逐渐提高，感染后28d达到相对最大值。结论构建了SjTYR1和SjTYR2的重组质粒并表达，2种重组蛋白均具有免疫原性和免疫反应性。SjTYR1和SjTYR2在血吸虫雌虫中特异表达，且在感染终宿主后24-28d转录水平升高。

摘要：合成生物学通过构建人工代谢途径,不仅可以发展高效的生物制造技术,还可以用于人类重要疾病的诊疗,为催生新的生物产业革命、促进经济可持续发展提供了重大机遇。该文围绕代谢组与代谢流量分析以及代谢建模、单细胞代谢表型组分析与分选、代谢物生物传感与时空调控等前沿技术,介绍现有状况和水平,综述分析这些技术如何助推合成生物学设计-构建-测试-学习(DBTL)循环,并对其发展前景进行展望。

摘要：目的利用生物信息学和实验相结合的方法,补平已知拼接序列中的缺失片段,获得日本血吸虫乙醛脱氢酶全长基因编码序列。方法通过生物信息学方法从已公开发布的日本血吸虫转录组数据库中提取乙醛脱氢酶表达序列标签(EST)序列数据,与其他物种的同源基因进行多序列联配,寻找分别与同一蛋白氨基酸序列的N端和C端配对的序列;设计引物,用RT-PCR扩增得到全长基因中间的缺失片段并测序。最终获得全长基因序列,并分析该蛋白的理化性质。结果找到日本血吸虫乙醛脱氢酶基因的可能EST序列片段8条,对其中的1对EST序列(AAW27891和AAW27047对应的氨基酸序列,中间缺少约80个氨基酸)进行blastn比对结果,预测为同一基因的2条片段。根据这两对EST序列设计正、反向引物,通过PCR扩增、对扩增产物进行测序及序列的生物信息学鉴定,找回了缺少的核酸序列,并与预测序列大小大致吻合(430bp)。组合成1条完整的日本血吸虫乙醛脱氢酶基因的编码序列(提交GenBank,其登录号为EF503564)。ORF全长为1596bp,编码531个氨基酸,编码的蛋白相对分子质量理论值为Mr57330.7,pI值为7.94,此序列的290～297位氨基酸与乙醛脱氢酶的模式序列[LIVMFGA]-E-[LIMSTAC]-[GS]-G-[KNLM]-[SADN]-[TAPFV]相匹配。结论利用生物信息学和实验相结合的方法,可以补平已知拼接序列中的缺失片段,获得日本血吸虫乙醛脱氢酶的全长基因编码序列。

摘要：从成分设计和结构控制着手,在木糖醇部分取代1,8-辛二醇与柠檬酸聚合反应制备聚(柠檬酸-辛二醇-木糖醇)酯(POXC)的基础上,采用POXC预聚体与磷酸钙骨水泥(CPC)悬浮体三维打印了孔道贯通的POXC/CPC多孔复合预支架,并进一步采用固化反应制备得到该复合支架。探索了材料的可打印参数,评价了复合支架的降解性、润湿性以及生物相容性。结果表明,POXC的降解速率随着木糖醇取代度的增加而增大。56d后,POXC/CPC降解率高达43%,对照组聚(1,8-辛二醇-柠檬酸)酯/CPC(POC/CPC)降解率近10%,这是由于POXC与复合支架的贯通孔结构的协同作用所致。木糖醇的引入及其与CPC的复合大大提高了支架的亲水性,有利于细胞的黏附和增殖。POXC/CPC支架具有贯通的大孔结构、良好的生物相容性和降解性,可促进骨缺损的修复。

摘要：从田间黄瓜细菌性萎蔫病植株分离获得病原菌,比对其近源种的16S rDNA序列,确定该病原菌为嗜维管束欧文氏菌(Erwinia tracheiphila),并设计出特异引物ET-P1/ET-P2.经过对该引物的PCR扩增条件优化,扩增出一条794 bp的黄瓜细菌性萎蔫病菌特异条带,检测灵敏度达100 fg/μL,可准确扩增出黄瓜发病植株和根围土壤中的DNA片段.

摘要：目的构建一种新型钙磷硅基活性骨修复材料,研究材料成分、孔道结构和是否负载生长因子对支架力学性能、细胞黏附性能和骨组织形成过程的影响。方法以磷酸钙骨水泥(CPC)、介孔硅酸钙(MCS)为原料,采用3D打印技术构建不同孔道结构的MCS/CPC复合支架,在扫描电子显微镜下观察支架内部孔道结构,通过万能力学试验机测试各组支架的最大抗压力学性能,用四甲基偶氮唑盐法测试各组支架的细胞黏附性能。建立大鼠颅骨原位缺损修复模型,在支架上负载重组人骨形态发生蛋白(rhBMP)-2制备得到钙磷硅基活性多孔支架(MCS/CPC/rhBMP-2),考察CPC、MCS/CPC和MCS/CPC/rhBMP-2支架的组织相容性与成骨性能。结果采用3D打印技术能够实现对钙磷硅基骨修复支架内部孔道结构的可控制备。垂直孔设计大小为350μm的MCS/CPC支架具有适宜的孔隙率和抗压力学强度(分别为56.6%和9.8 MPa);细胞相容性良好,有利于细胞黏附。负载rhBMP-2可显著加快新生骨组织形成,植入MCS/CPC/rhBMP-2复合支架初期纤维组织即可在连通孔道中自由生长,在植入12周后,MCS/CPC/rhBMP-2支架新生骨面积明显高于CPC和MCS/CPC支架,且新生骨组织形成过程与颅骨膜内成骨过程相似,具有一定的仿生效应。结论采用3D打印法制备的MCS/CPC/rhBMP-2支架材料具有规则的连通孔道,力学性能良好,促进成骨效果优异,是理想的新型骨缺损修复材料。

摘要：设计合成了与伊曲康唑具有协同活性的系列β-氨基酸聚合物。通过β-氨基酸N-硫代羧基酸酐(β-NTA)开环聚合的方法,将不同比例疏水性单体DL-β-正亮氨酸N-羧基硫代羰基环内酸酐(简称Bu)和阳离子单体N(α)-Z-DL-2,3-二氨基丙酸N-羧基硫代羰基环内酸酐(简称DAP)进行共聚,得到了系列β-氨基酸聚合物(DAP_(x)Bu_(y))_(n)。抗菌测试表明,制备的(DAP_(x)Bu_(y))_(n)聚合物可通过协同增效,有效逆转白色念珠菌(***)对伊曲康唑的耐药性,使伊曲康唑的抗真菌最低抑制质量浓度从单药的大于200μg/mL降低至协同后的3.1μg/mL,即从无效逆转为高效抗真菌活性。此外,(DAP_(x)Bu_(y))_(n)聚合物在400μg/mL的高浓度下基本没有造成明显的人血红细胞溶血和细胞毒性。(DAP_(x)Bu_(y))_(n)聚合物能实现高效协同增效和逆转真菌对伊曲康唑的耐药性。

摘要：目的改进西达本胺(chidamide)的合成工艺。方法以3-溴吡啶为起始原料,经无配体Heck反应、甲酯水解、与4-氨甲基苯甲酸进行酰胺化后,与4-氟-1,2-苯二胺再次酰胺化,制得西达本胺。结果与结论目标物西达本胺的结构经MS和^(1)H-NMR谱确证,纯度为99.6%(HPLC面积归一化法),总收率61%(以3-溴吡啶计)。本路线具有后处理简便、原子利用率高、高效经济、三废少等优势。

摘要：【目的】设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性,为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH,将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒,转导HEK293T细胞,经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定,得到大小分别为8172 bp的载体片段和1521 bp的E2-GM-CSF基因片段,表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体;细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1686 bp的条带,表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组;Western blotting分析获得约70 ku的条带,证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达;SDS-PAGE验证显示,纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带,纯度较高,大小约70 ku;小鼠免疫血清ELISA检测结果表明,表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性,免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体,免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900,免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8100,远高于E2蛋白的1∶1800。【结论】利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白,为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗,同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。

摘要：揭示工程化设计的人工合成途径与底盘细胞整体代谢网络的交互作用及适配性机制是合成生物学研究的关键共性科学问题。细胞内酰基CoA是微生物合成生物活性物质如聚酮、芪类及黄酮类、生物碱、生物能源及生物材料等的前体,提高细胞内酰基CoA供应水平,能够促进微生物合成产率升高;酰基CoA也是蛋白质酰基化修饰的酰基基团供体,酰基CoA积累导致合成代谢途径相关酶的酰基化水平提高,抑制代谢酶催化活性及合成效率。本文从酰基CoA平衡及酰基化修饰的角度,重点阐述了酰基CoA双重效应(酰基化供体及代谢前体)的相互影响与平衡,随后通过红霉素、丁醇、赤松素的实例总结了翻译后修饰代谢工程在调节微生物合成途径各元件间、合成途径与底盘之间的适配性,促进产物合成方面的实际应用。