摘要：目的 以苦瓜降糖多肽P基因为例,探讨用寡核苷酸片段体外拼装基因的方法。方法根据已知苦瓜降糖多肽P的蛋白序列和大肠杆菌的密码子偏爱性,反向翻译出可在大肠杆菌内表达的苦瓜降糖多肽P基因,设计24条40 bp的降糖多肽P基因寡核苷酸片段引物,通过PCR进行寡核苷酸片段的扩增和拼装。将拼装好的多肽P基因的cDNA与pET-32a载体连接后,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA纯化后检测其对四氧嘧啶引起的糖尿病小鼠的降糖活性。结果苦瓜降糖多肽P基因经2轮PCR扩增后,即可见目的 条带;经第3轮PCR扩增,即可见清晰的目的 条带。经测序鉴定,与设计的降糖多肽P基因序列完全一致。重组蛋白在*** BL21(DE3)中获得可溶性表达,且可与鼠抗His单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度达90%以上,产量为10 mg/L,其对四氧嘧啶引起的糖尿病小鼠具有降糖活性。结论体外基因拼装法是一种有效获取目的 基因的方法,可进行密码子偏爱性设计,在宿主系统中有效表达目的 基因。

摘要：通过测定黄瓜黑星病菌(Cladosporium cucumerinum)rDNA的ITS序列,比对近缘种及瓜类几种重要病原菌的ITS序列,设计出特异性引物HX-1/HX-2,经过对引物HX-1/HX-2PCR条件的优化,可以扩增出1条190bp的黄瓜黑星病菌特异性DNA条带,灵敏度达到1pg/μL。进一步将引物HX-1/HX-2和瓜类枯萎病菌、瓜类蔓枯病菌特异检测引物Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组合,建立三重PCR体系,可一次检测出瓜类黑星病菌、瓜类枯萎病菌、瓜类蔓枯病菌3种瓜类植物重要的病原菌。建立了可以应用于田间瓜类黑星病菌PCR检测技术和瓜类主要病害三重PCR检测技术,对瓜类病害的诊断和防治具有重要的指导作用。

摘要：通过在进气中混入部分CO_2气体,在分批培养和恒化培养两种培养方式下研究了不同dCO_2水平对黑曲霉产糖化酶的影响。在分批培养方式下,较高的dCO_2对细胞的生长具有抑制作用,并且随着dCO_2水平的增加,抑制程度加强,但是较高浓度的dCO_2对糖化酶的合成有利。而恒化培养时,低稀释率D_1=0.05/h下,较高的dCO_2对细胞的生长并没有明显的抑制作用,但有利于糖化酶合成。高稀释率D_2=0.08/h下,较高的dCO_2对细胞的生长有明显的抑制作用,并且抑制程度随着dCO_2水平的增加而加大。以上实验结果表明,dCO_2对细胞生长和糖化酶合成的影响不仅和dCO_2水平有关,也和培养方式及细胞所处的特定代谢状态有关。这对于黑曲霉产糖化酶工业放大过程中补料分批发酵中比生长速率的设计具有很好的指导作用。

摘要：【目的】研究bagremycin产生菌链霉菌Tü4128中编码酪氨酸酶样铜酶的bagZH基因的功能。【方法】基于同源重组技术敲除bagZH基因,利用HPLC和LC-ESI-MS分析其次级代谢产物谱。在E. coli BL21(DE3)中异源表达BagH并分离纯化,分别以邻氨基酚和3,4-AHBA为底物,利用LC-ESI-MS分析BagH催化产物。【结果】HPLC显示,bagZH基因敲除突变株的bagremycin产量显著降低,回补bagZH基因表达盒后bagremycin产量有所上调。LC-ESI-MS分析bagZH基因敲除突变株的次级代谢产物谱,结果显示,保留时间为3.18 min的新产物分子量为286.32 g/mol,与推测的3,4-AHBA在体内酯化合成的产物分子量吻合。体外生化分析显示,BagH能将邻氨基酚的邻位氨基氧化为亚硝基(保护基团)。【结论】本文首次鉴定了bagZH基因编码的酪氨酸酶样铜酶参与bagremycin生物合成。BagH负责将3,4-AHBA的邻位氨基氧化为亚硝基(保护基团)避免自身酯化,待与反式对香豆酸衍生物缩合后,再由胞内的还原酶将保护性亚硝基还原为氨基,最终合成bagremycin A和bagremycin B。我们的研究结果为bagremycin作用机制的深入研究以及高产菌株的理性设计与改造提供了基础和参考。

摘要：用两水平因子设计考察培养基中的所有七个成分对他克莫司产量的影响大小,选出其中影响较大的葡萄糖、酵母粉、花生粉和NaCl进行最佳浓度范围考察,然后用中心组合方法及响应面分析确定最佳配比,他克莫司的产量提高了55%左右。

摘要：利用Plackett-Burman设计法析出影响必特螺旋霉素效价的四个最显著的因素,以Box-Behnken设计法及响应面分析法确定了主要因素的最佳浓度,即鱼粉22.8g/L,酵母粉2.44g/L,CoCl29.25mg/L,NaCl 9.13g/L,此时必特螺旋霉素效价为2245μg/ml。新配方验证结果表明必特螺旋霉素效价和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量在96h分别达到2380μg/ml和54%,比原配方分别提高了53%和20%。

摘要：实现了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞高密度培养过程的稳定。以表达IgG抗体的流加培养过程为研究对象,首先通过"鱼骨图"分析、FMEA风险评估剖析潜在的关键控制参数,其次通过DOE(实验设计)方法确定和优化关键控制参数及其范围。结果表明,在99个培养过程参数中搜寻并确认了8个关键控制参数及其范围。经优化控制后,表达IgG抗体的流加培养过程批次间抗体产量差异从200%下降至10%。基于QbD理论,能快速有效地实现CHO细胞培养生产抗体产量的稳定性,有利于保证抗体药物生产的安全性以及保障企业的经济效益。

摘要：采用HADAMARD统计设计方法建立了适于重组BHK细胞培养和vWF蛋白表达的无血清培养基SFMA。用SFMA进行重组BHK细胞的批培养,细胞生长明显优于有血清培养(DMEM+FBS(φFBS=0.05))和无血清培养基SFM- 的培养,最大细胞密度可分别提高16.7%和40%。同时,在培养的96h,蛋白的表达水平比有血清培养提高了18.7%,SFMA维持培养48h的vWF蛋白的表达水平比SFM- 提高了50%。

摘要：分析基于OLE自动化、内嵌VBA、键盘模拟以及智能网络代理技术的4种程序自动化策略。实现基于OLE自动化和内嵌VBA技术的生物质谱数据处理自动化程序AutoDataExplorer、基于键盘模拟技术的引物设计自动化程序OligoMask、基于网络智能代理的质谱数据库搜索自动化程序BatchMascot,在高通量蛋白质组学数据采集和分析工作上的成功应用证明其能使软件设计更方便快捷。

摘要：选取氧化葡萄糖酸杆菌16S rRNA作为看家基因,利用Primer Premier 5 0软件设计特异性引物,以总基因组为模板,建立氧化葡萄糖酸杆菌实时定量PCR方法。选取山梨醇脱氢酶大亚基.sldA和小亚基sldB为研究对象,以看家基因16S rRNA的表达作为内参,测得山梨醇脱氢酶大小亚基的转录水平一致,均为看家基因的68%。