摘要：在用固定化产腈水解酶细胞填充床反应器催化制备尼克酸的实验中,通过构建代数形式的经验方程,成功地完成了反应器操作参数的设计。通过分析已知的填充床反应器的轴向扩散模型(一维)的数值解,得到一个经验方程:L=7.898u cS0+114.6u+0.028,该方程描述了3个关键操作参数(柱长L,流速u和底物浓度cS0)之间的关系。在底物转化率和反应器孔隙率分别为95%和0.11的前提下,以所得的代数方程为约束条件进行了最优化计算,求解出最优操作参数,使尼克酸的产量达到最高。

摘要：红霉素(erythromycin)是由绛红色糖多胞菌(Saccharopolyspora erythraea)发酵生产的次级代谢产物,其生产水平不仅受发酵工艺的影响,也受反应器结构影响。为解决红霉素发酵过程放大问题,本研究采用时间常数法和计算流体力学(computational fluid dynamics,CFD)数值模拟验证相结合的方法设计了500 m^(3)超大规模红霉素耗氧发酵生物反应器。首先,通过对50 L反应器红霉素发酵过程研究,发现溶氧是关键性限制因素,通过氧消耗速率(oxygen uptake rate,OUR)等参数分析计算得到设备的氧供应时间常数t_(mt)需小于6.25s。然后,基于时间常数法和经验关联式理性设计500 m^(3)反应器搅拌桨叶组合方式,即底层BDT8桨叶+两层MSX4桨叶的搅拌桨组合,并通过经验公式及CFD方法对设计结果进行了模拟验证。两种验证方法结果均表明500 m^(3)反应器采取底层BDT8桨叶+两层MSX4桨叶的组合方式时设备的氧供应时间常数小于6.25 s,且反应器内流场特性(如持气率、剪切率和速度矢量等)均能满足红霉素大规模发酵的需要。经实际发酵验证,设计的生物反应器能够满足红霉素的工业规模发酵应用。

摘要：在氧化葡萄糖酸杆菌中建立一种调控基因表达的工具。通过顺式/反式作用的非编码小RNA与核糖体结合位点(RBS)的相互作用,在翻译水平上对氧化葡萄糖酸杆菌中目标基因的表达进行调控。以绿色荧光蛋白作为报告基因,在所构建的顺式调控系统中,插入RBS上游的顺式阻遏序列,能够在转录后与RBS形成茎环结构,从而抑制报告基因的表达。这一茎环结构能够被与顺式阻遏序列具有更高亲和力的抗阻遏序列打开,从而重启报告基因的翻译;在所构建的反式调控系统中,由独立启动子控制转录的非编码小RNA与RBS互补形成双链,通过阻碍核糖体与mRNA的结合抑制报告基因的表达。在此基础上,设计并导入了一系列反式作用的小RNA,实现了对氧化葡萄糖酸杆菌中内源基因pstI表达的抑制。本研究提供了一种在氧化葡萄糖酸杆菌中不同于传统基因敲除的调控基因表达的方法。

摘要：为在大肠杆菌中高效表达乳酸片球菌素(PED),按照美国国立生物技术信息中心公布的PED基因序列设计合成引物,以乳酸片球菌基因组DNA为模板,用多聚酶链式反应扩增PED结构基因特异片段,构建编码组氨酸标记硫氧还原蛋白融合PED的重组表达质粒pET32c-PED,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。在异丙基硫代半乳糖苷诱导后融合蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的28%。经镍亲合层析纯化的融合蛋白用肠激酶裂解,再经超滤纯化,可得78%的收率。融合蛋白没有抗粪肠球菌细菌素活性,被分开的PED恢复了抑菌活性。

摘要：以 GC含量高达 74%的带小棒链霉菌 ( ***)染色体 DNA为模板 ,从引物设计、退火温度、有机辅剂及 DNA聚合酶等方面改善 PCR反应体系和扩增条件 ,成功地克隆得到了异青霉素异构酶的 cef D基因。改进后的 PCR体系中 φDMSO=0 .0 5并加入适量的 Taq DNA聚合酶 ,退火温度比常规选择高一些 ,从而克服了常规 PCR法扩增链霉菌基因遇到的二级结构复杂、引物与模板难以配对及引物间和引物内部易形成碱基配对等问题。改进后的 PCR法提高了链霉菌基因克隆的效率 ,也可以广泛应用于高

摘要：3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是微生物甾体降解途径中的关键酶,在甾体药物制备中有重要价值。以本实验室从土壤中自行筛选的分枝杆菌Mycobacterium ***-01为出发菌株,利用红平红球菌Rhodococcus erythropolis SQ1已报道的ksh序列与已全基因组测序的分枝杆菌序列数据库进行比对分析,根据同源基因设计简并引物获得部分ksh序列,通过染色体步移扩增出全长ksh(命名为M.S.-ksh),该基因与耻垢分枝杆菌*** mc2155的ksh同源性为85%。构建pET32-ksh表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高表达重组转化子菌株,经IPTG低温诱导,SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,用Ni2+亲和层析柱纯化,纯度达90%以上。本研究为利用基因工程菌进行工业化生产甾体药物奠定了基础。

摘要：本文以一株产透明质酸(hyaluronic acid, HA)的兽疫链球菌为研究对象,在5.00 L发酵罐和250 mL摇瓶中考察了温度和pH对HA发酵过程中菌体生长、HA产量、HA分子量大小以及分布的影响。结果显示,当pH为7.00时适合菌体生长,而在产物合成阶段更高的pH条件8.00下HA比生成速率更高。据此,设计了分段和周期性改变发酵过程pH的调控模式,研究表明:分段pH调控方式与pH为7.00时相比HA浓度没有提高,但是pH在7.00和8.00之间进行的分段调节时分子量提高了10.60%,同时显著降低了多分散系数,另外在pH在7.00和8.00之间进行的分段调节的同时在33℃的培养温度下收获时HA分子量提高了18.70%,而为后续工业化生产分子量更为集中的HA,同时降低不同分子量HA分离成本提供了方向。

摘要：将克隆自卡波霉素产生菌的4"-O-异戊酰基转移酶基因整合到螺旋霉素产生菌S trep tomy ces sp iramy ceticus F-21的染色体上,构建成一株稳定的生物工程菌W SJ-1-195,它产生的一组以4"-O-异戊酰螺旋霉素为主要成分的多组分基因工程新型抗生素命名为必特螺旋霉素。针对目前没有适合必特螺旋霉素产生菌的合成培养基,所以本文顺序通过部分因子析因设计法、最速上升实验、中心组合实验,并利用统计学软件SA S V 8对实验数据进行分析,确定了必特螺旋霉素合成培养基的组成,为以后对必特螺旋霉素生理生化特性的研究提供基础。经过优化后必特螺旋霉素的发酵效价从173μg/m l提高到1880μg/m l。

摘要：目的:上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)在正常细胞中的表达局限于上皮基底外侧细胞,且具有隐蔽性,而在包括膀胱癌在内的多种上皮性癌症中过表达且处于易结合的状态,是抗肿瘤治疗的特异性有效靶标之一;以EpCAM作为膀胱癌靶向治疗的靶点,探索高效、安全的膀胱癌新型治疗方法。方法:在分子水平利用柔性肽GGGGS将EpCAM单链抗体4D5MOCB与毒素PE38KDEL连接设计制备免疫毒素,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并研究其与膀胱癌细胞的结合和对癌细胞生长的抑制作用。结果:4D5MOCB介导的免疫毒素具有良好的选择性,与EpCAM高表达的膀胱癌细胞5637结合良好,其结合率约为阴性细胞结合率的169倍,并能有效抑制癌细胞生长,IC50最低可达0.5 pmol/L,同时能够抑制细胞克隆形成和细胞迁移,诱导细胞凋亡;免疫毒素与EpCAM阴性细胞HeLa不结合,也不具有抑制细胞活性的作用。结论:制备的基因工程免疫毒素具有较好的选择性,能够有效抑制阳性癌细胞的增殖和转移,且比相同抗原的抗体药物偶联物(antibody-drug conjugates,ADC)的制备更简单,均一性更好,为免疫毒素应用于实体瘤的治疗提供了实验基础。

摘要：采用Mixture与响应面实验设计相结合的方法开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基。在实验室已知配方的6种培养基A-F的基础上,通过Mixture实验筛选出BHK-21细胞无血清培养基的最优组合为A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。利用响应面法针对培养基中的几种关键组分进行浓度优化,确定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和钙离子的最优浓度分别为3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。该无血清悬浮培养基能很好地支持BHK细胞悬浮生长,培养时细胞最大活细胞密度可达140.21×105个/m L,比商业培养基提高了1.95倍。采用Mixture试验设计和响应面分析法能够在较短的时间内开发出适合BHK-21细胞生长的无血清悬浮培养基,为采用BHK-21细胞大规模工业化生产口蹄疫疫苗奠定了基础。