摘要：目的探讨小干扰RNA(siRNA)在弓形虫体内的对目的基因的表达调节作用。方法以弓形虫嘌呤代谢过程中的关键酶——次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)编码基因为靶标,合成3对siRNA,以电穿孔的方式将不同的浓度的siRNA转染弓形虫。采用荧光定量PCR及[3H]-次黄嘌呤摄入量分别检测弓形虫HXGPRT mRNA及酶合成量。结果在针对HXGPRT编码基因设计的3对21nt的siRNA中,有1对(siRNA415)能明显降低HXGPRT mRNA水平及酶合成量。在转染后24h,4μmol/LsiRNA415电转弓形虫的HXGPRT mRNA水平及[3H]-次黄嘌呤摄入量分别降为模拟电转弓形虫的0.36±0.04及0.51±0.03倍(P<0.05)。结论21nt的siRNA在弓形虫体内能有效抑制目的基因的表达。siRNA在弓形虫体内的应用将为阐明未知基因的功能和抗弓形虫药物的筛选提供有力的工具。

摘要：为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5(Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5)基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期(速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊)中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。

摘要：目的:克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10(CFP10)基因,并对其进行序列分析。方法:自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFP10基因设计引物。通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果:PCR产物电泳显示扩增片段约为300 bp,测序获得的片段开放编码框由303 bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100%,推导出编码氨基酸序列同源性为100%。结论:成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFP10基因序列无差异。

摘要：目的运用PCR对刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH、PRU、VEG株速殖子和HFF、Vero细胞系以及SPF级昆明鼠脑组织所得DNA样品进行特异性扩增,鉴定并筛选出适合用作弓形虫实时荧光定量PCR(q PCR)分析的内参引物。方法体外培养并无菌收集HFF、Vero细胞系及弓形虫RH、PRU、VEG株速殖子,SPF级昆明鼠经颈椎脱臼处死无菌采集脑组织,并提取基因组DNA。合成弓形虫MIC6基因(Toxo DB:TGME49_218520)特异性引物P1/P2,经PCR扩增鉴定所得样品是否含有弓形虫DNA成分,设空白对照。依照Toxo DB数据库弓形虫ACT1基因参考序列(Toxo DB:TGME49_209030)设计引物,经NCBI Primer-BLAST比对分析后进行合成特异性引物P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10和P11/P12,预期片段大小均为121 bp。以弓形虫RH DNA为模板,采用梯度PCR优化ACT1基因内参引物的退火温度。运用已优化条件对待检DNA样品进行PCR特异性扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,鉴定出适合用于弓形虫q PCR定量分析的内参引物。结果 PCR扩增弓形虫RH、PRU和VEG株DNA MIC6基因时均出现一条长度约为1 050 bp的条带,且空白对照和其他样品无此条带,与预期结果一致,表明所得DNA样品可用。优化退火温度时发现,除P7/P8外其他引物均不受退火温度影响,56℃适合用于PCR或q PCR扩增ACT1基因目的片段的退火温度。以56℃为退火温度对待检DNA进行检测时发现,扩增弓形虫阳性样品时所有引物均能产生1条大小约为121 bp的条带,空白对照无此条带,与预期结果一致。此外,引物P7/P8、P9/P10扩增Vero细胞系和引物P3/P4、P5/P6、P9/P10扩增昆明鼠脑组织DNA样品时均有杂带出现,且有杂带大小约为121 bp;引物P11/P12扩增弓形虫阴性DNA样品时均无杂带出现。结论引物P11(5′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′)和P12(5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)适合分别用作弓形虫q PCR定量分析时扩增ACT1靶基因的上游和下游引物。

摘要：　目的　克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因,探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制,从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。　方法　以曼氏血吸虫的 TH cDNA为模板设计引物,以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链,将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列,克隆入 pGEM T easy载体,用单酶双切法和DNA测序进行鉴定,并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。　结果　自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为 480 bp的 DNA片段,经测序与曼氏血吸虫 TH的同源性为 87%。结论　成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域,为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。

摘要：设计并制备兔抗弓形虫棒状体蛋白ROP18的特异性表位肽抗体,并对其进行鉴定及初步应用。运用在线蛋白质分析软件Bepi Pred 1.0 Server预测和分析ROP18的抗原表位,人工合成选定的两段优势表位肽,与载体蛋白BSA偶联后分别免疫新西兰兔制备抗ROP18血清,通过ELISA鉴定其效价,Western blot鉴定其特异性,并将这两种抗体应用于免疫荧光和免疫共沉淀技术。间接ELISA结果显示两种抗体效价分别为1∶16 000、1∶64 000;Western blot结果显示,两种抗体均能够特异性识别弓形虫速殖子中的内源性天然ROP18蛋白和外源重组ROP18蛋白;免疫荧光检测到ROP18定位于弓形虫速殖子顶端及感染细胞的纳虫泡膜上;免疫共沉淀未能成功下拉目标蛋白。成功获得ROP18的两种表位肽多克隆抗体,效价高且特异性强,并成功应用于免疫荧光定位,为进一步探究ROP18在弓形虫中的功能和作用奠定了基础。