摘要：目的:探讨使用CRSIPR/Cas9技术删除CTL的免疫检查点CTLA-4后CTL的抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果及其作用机制。方法:针对CTLA-4设计特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)并构建sgRNA/Cas9质粒,使用慢病毒载体转染质粒至CTL获得删除CTLA-4的CTL(CTLA-4 KO CTL),并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率。BALB/c裸鼠随机分为2组进行实验,预防性注射CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组),3 d后接种结肠癌细胞株LS174-T,观察成瘤率及成瘤时间。建立结肠癌移植瘤裸鼠模型,成瘤后裸鼠随机分为2组,分别给予CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组)进行细胞治疗,观察移植瘤的体积、裸鼠的生存时间,并检测移植瘤裸鼠血清中TNF-α及IFN-γ分泌水平。结果:设计sgRNA并成功构建以慢病毒为载体的CRSIPR/Cas9系统,使用构建好的CRSIPR/Cas9系统转染CTL细胞,转染效率最高可达(28.80±0.62)%,转染后以流式细胞术检测CTLA-4的删除效率,CTLA-4 KO CTL组的CTLA-4表达较CTL组显著降低[(0.91±0.25)%vs(42.70±2.72)%,P<0.01]。预防实验中,实验组结肠癌移植瘤发生率明显低于对照组(33.33%vs 100.00%,P<0.01)。治疗实验中,实验组肿瘤体积较对照组显著减少[(503.0±23.9)vs(911.2±51.4)mm^3,P<0.05],实验组裸鼠相较于对照组生存时间明显延长(中位生存期:78 vs 42 d,P<0.05),实验组裸鼠血清TNF-α[(268.93±17.04)vs(148.26±20.07)pg/ml,P<0.05]及IFN-γ[(315.38±18.67)vs (202.92±29.32) pg/ml,P<0.05]的分泌水平较对照组明显增高。结论:以CRSIPR/Cas9技术成功删除CTL中免疫检查点CTLA-4后可以显著抑制裸鼠结肠癌移植瘤的成瘤率、增强CTL对荷结肠癌裸鼠的抗肿瘤作用,并明显增高荷瘤鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平。

摘要：目的筛选有效沉默KLF4基因表达的siRNA,观察KLF4基因沉默对人肝星状细胞HSC-LX2生物学行为的影响。方法设计并化学合成针对人KLF4基因的3对siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3),转染人肝星状细胞HSC-LX2,以转染非特异siRNA作为阴性对照。采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)和Western blot方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表达情况,筛选出沉默KLF4效果最好的1个siRNA,将其转染入HSC-LX2后,用MTT法检测KLF4沉默对HSC-LX2增殖的影响。采用ELISA法检测细胞培养上清中的转化生长因子1(transforming growth factor,TGF-1)、白介素1(interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达情况。结果Real-time RT-PCR和western blot均显示siRNA3沉默效果最好。故后续试验均采用siRNA3沉默KLF4的表达。MTT实验结果显示,在转染siRNA3,12 h、24 h和48 h后,细胞活力出现明显下降。ELISA结果显示,转染siRNA3,48 h以后,TGF-β1、TNF-α、IL-1β表达量也明显降低。结论 siRNA3可有效沉默KLF4基因表达,KLF4基因沉默可以抑制HSC-LX2的增殖,影响其生物学行为,使细胞中的促进胶原表达的三种细胞因子TGF-1、TNF-α以及IL-1表达量下降。

摘要：目的探讨大鼠KLF4基因沉默,对大鼠肝星状细胞HSC-T6胶原代谢的影响及其机制。方法设计并构建针对大鼠KLF4基因的3个干扰质粒(p GPU6-1,p GPU6-2,p GPU6-3)以及阴性对照。采用实时荧光定量RTPCR(Real-time RT-PCR)和western blot的方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表达情况,筛选出沉默最好的干扰质粒,将筛选出来的干扰质粒p GPU6-3,转染大鼠HSC-T6细胞。转染24 h和48 h后分别采用Real-time RT-PCR法和western blot的方法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)mRNA和蛋白的表达。Real-time RT-PCR法以GAPDH为内参照,用2-ΔΔCt法进行分析计算。western blot的方法以β-actin蛋白为内参照,进行分析。结果 Real-time RT-PCR结果显示,p GPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TIMP-1相对于对照组的mRNA表达分别下降为0.358±0.038,0.298±0.041和0.478±0.048;而MMP-13 mRNA的表达则上升为1.712±0.034。Western Blot检测中,p GPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后,以β-actin为内参照,Ⅰ型胶原蛋白,Ⅲ型胶原蛋白和TIMP-1蛋白的表达分别下降为0.326±0.051,0.283±0.074和0.331±0.039;而MMP-13蛋白的表达则上升为1.273±0.038。结论 KLF4基因沉默可以显著减少大鼠HSC-T6细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达,其机制与增加MMP-13表达,而抑制TIMP-1的表达有关。

摘要：目的评价胸腺五肽、参芪扶正注射液联合使用对晚期肺癌患者的临床疗效，探索两者联合对晚期肺癌患者T淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞的影响及对生活质量的影响，为恶性肿瘤的临床治疗提供理论依据。方法选用丧失手术及放、化疗机会的肺癌患者68例，采用2×2析因设计将研究对象随机分为常规支持治疗组、胸腺五肽治疗组、参芪扶正注射液治疗组、胸腺五肽联合参芪扶正注射液治疗组。全部病例于治疗前后分别采静脉血3ml，检测T淋巴细胞群（CD4＋、CD8＋、CD4＋／CD8＋）及自然杀伤细胞等免疫学指标，评价患者免疫功能变化。采用Karnofsky量表评价患者生活质量。结果胸腺五肽和参芪扶正注射液以及两者的交互作用在免疫学指标和生活质量评分的变化差异均有统计学意义（P〈O．05）。结论将胸腺五肽和参芪扶正注射液联合使用，两者具有正向交互作用，能产生更好的疗效，具有良好的应用前景。