摘要：本研究旨在建立志贺氏菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增技术real-time RPA检测方法。根据志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)的保守序列设计引物及exo探针,利用荧光检测设备实时监控反应进程,在39℃恒温下20 min即可完成检测。该方法特异性扩增志贺氏菌,对非志贺氏菌无扩增;以志贺氏菌基因组DNA为模板,该方法的检测灵敏度为3.5×10^-3 ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染试验表明,当鸡肉、西兰花样品污染量为9 CFU/25g,增菌时间为8 h时,即可通过real-time RPA方法检出志贺氏菌。在人工污染试验中,real-time RPA和real-time PCR检测结果一致,而前者仅需7~12 min,后者则至少需要35 min(Ct值为27~34之间)。本研究建立的志贺氏菌real-time RPA方法特异性强,灵敏性高,反应时间短,操作方便,为食源性致病菌检测提供了一个新的技术平台。

摘要：目的建立TaqMan探针实时荧光PCR法快速检测肉制品中鸭源性成分的分析方法。方法以鸭生长激素(growthhormone,GH)基因为靶基因,基于特异性保守序列设计引物和TaqMan探针,优化反应体系和反应条件,建立了鸭源性成分实时荧光PCR(real-timePCR)检测方法。结果所建立的real-timePCR方法特异性强,仅对鸭基因组DNA出现特异性扩增曲线,对牛、羊、猪等其他异源性动物基因组DNA均无扩增曲线;灵敏性高,以鸭基因组DNA为模板,检出限为1.0 pg;重复性好,不同浓度基因组DNA测定的Ct值变异系数小于4%。使用建立的real-time PCR方法对200份市售肉制品进行检测,在11份肉制品中检出鸭源性成分,同现行行业标准SN/T3731.5—2013检测结果一致。结论本研究所建立的real-timePCR方法检测具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点,适用于肉制品中鸭源性成分快速检测。

摘要：目的建立龙利鱼和巴沙鱼源性成分的双重实时荧光聚合酶链式反应(PCR)快速检测方法。方法根据13种龙利鱼的线粒体16S rRNA序列,设计通用引物和探针,根据巴沙鱼的线粒体cytb基因序列设计引物和探针,通过优化扩增反应体系进行双重实时荧光PCR扩增,达到快速检测产物的目的。结果本方法特异性良好,龙利鱼基因组DNA灵敏度可达到10^(-3)ng,在与鲤鱼粉混合的鱼肉制品中可检测,质量分数灵敏度达到1%。巴沙鱼基因组DNA灵敏度可达到10^(-4)ng,在与龙利鱼粉、大西洋鳕鱼粉混合的鱼肉制品中均可检测,质量分数灵敏度达到0.1%,在与米粉混合的鱼肉制品中可检测,质量分数灵敏度达到0.001%。结论本方法检测特异性高、所需时间短、灵敏度高,可满足鱼肉制品中龙利鱼真伪鉴别和巴沙鱼掺假的检测要求。

摘要：目的建立巴沙鱼源性成分的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)快速检测手段。方法根据巴沙鱼的线粒体cytb基因序列设计引物,使用实时荧光PCR进行扩增,从而达到快速检测产物的目的。结果此方法特异性良好,巴沙鱼基因组DNA灵敏度可达到10^(-4) ng,在与婴幼儿米粉、儿童副食芝麻粉、鸡肉粉和大西洋鳕鱼粉混合的鱼肉制品中均可检测,且质量分数灵敏度均可达到0.01%。结论本方法检测特异性高、时间短、灵敏度高,可满足鱼肉制品中巴沙鱼掺假的检测要求。

摘要：简要介绍当前海关科技资源的总体概况,从践行总体国家安全观、优化口岸营商环境、提升履职把关成效等方面对近几年海关科技取得的成效进行概括。基于扩大对外开放、维护国门安全、促进跨境贸易、推进科技创新等需求阐明现阶段海关科技面临的挑战,并对海关科技工作在体制机制方面存在的短板问题进行剖析,同时,有针对性地从融入地方科技顶层设计规制、纳入地方科技人才队伍、列入地方技术创新平台建设、嵌入地方成果转化链条、并入地方科普体系建设等方面提出海关与地方科技融合发展的建议对策。

摘要：为建立4种肉类(牛肉、猪肉、鸡肉和马肉)成分的鉴别方法,本试验基于动物线粒体细胞色素b基因,设计1条通用正向引物CF,以牛、猪、鸡和马的特定DNA序列设计4条特异性反向引物R,优化反应条件,建立了多重PCR检测方法。该方法对牛、猪、鸡和马肉的检测灵敏度为10×10^(-3) ng/μL,具有良好的特异性。对80份市售肉制品样本进行检测,检出掺假样本31份,与本实验室常用的荧光定量PCR试剂盒检测结果一致。本试验建立的多重PCR方法能够有效地对牛、猪、鸡和马源性成分进行快速检测。

摘要：为建立一种灵敏、特异、快速、高效地鉴定纺织品基质中大肠杆菌O157:H7的方法,筛选出大肠杆菌O157:H7特有的rfbE基因保守序列,设计PCR特异性引物和荧光双标记探针,结合免疫磁珠技术,集成创新开发一种目标菌低浓度、不可培养情况下的样品中高效、快速富集分离大肠杆菌O157:H7的技术,建立了一种针对纺织品基质的免疫磁珠富集-实时荧光定量PCR方法,其检测下限可达8 CFU/mL。利用该方法对收集到的30份阳性样品进行鉴定,鉴定结果与传统方法结果100%吻合。结果表明,新建方法稳定性强,实现了纺织品中大肠杆菌O157:H7的快速灵敏鉴定。

摘要：目的建立一种快速检测铜绿假单胞菌的实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增(real-time RAA)方法。方法基于铜绿假单胞菌ecfX基因设计特异性引物和exo探针,通过灵敏性、特异性和疑似菌株检测评估所建立方法的有效性。结果Real-time RAA方法在39℃等温条件下反应20 min即可实现对铜绿假单胞菌的有效检测;特异性强,仅对铜绿假单胞菌出现特异性扩增;灵敏性高,对铜绿假单胞菌基因组DNA的检出限为3.0×10^3 fg/反应,对纯培养铜绿假单胞菌的检出限为1.0×10^3 CFU/反应。应用所建立的real-time RAA方法对分离的36株疑似铜绿假单胞菌进行检测,结果均为铜绿假单胞菌,同VITEK 2 Compact生化鉴定方法和real-time PCR方法结果一致。结论本试验所建立的real-time RAA方法反应快速、操作简单、可靠性高,可用于不同来源的铜绿假单胞菌的快速检测和鉴定。

摘要：本研究针对副结核分支杆菌(MAP)F57基因特异性保守序列,设计RPA引物和nfo探针,建立了快速检测MAP的结合侧流层析试纸条的肉眼可视化RPA检测方法(RPA-LFS)。结果显示,所建立的RPA-LFS方法在金属浴中39℃恒温振荡反应20 min后,将产物加至侧流层析试纸条中,可在5 min内实现对检测结果的肉眼可视化判定;所建立的RPA-LFS方法特异性强,仅对MAP产生扩增,与其他常见可引起牛腹泻的病原均无交叉反应;以含有F57基因全长的重组质粒pTOPO-T-F57作为模板,RPA-LFS的检出限为12 copies。进一步应用RPA-LFS方法对57份牛腹泻临床样本进行MAP检测,检出9份阳性结果,与实时荧光PCR方法检测结果一致。本研究建立的副结核分支杆菌可视化RPA-LFS方法操作简单,反应快速,不依赖于复杂精准的仪器设备、专业技术人员和严格的实验室环境条件,为养殖场一线的MAP现场检测提供了一种新的解决方案。

摘要：为建立检测牛支原体(M. bovis)的微滴式数字PCR(ddPCR)方法,本研究以牛支原体uvrC基因为靶基因,设计特异性引物和探针,采用方阵法对ddPCR退火温度、引物和探针浓度的优化,结果显示,建立的ddPCR方法最佳退火温度为62.6℃,最佳引物和探针终浓度分别为900 nmol/μL和250 nmol/μL。利用该方法检测M. bovis、牛传染性鼻气管炎病毒、牛鼻炎病毒B型、副结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛轮状病毒等,结果显示仅能够特异性检测到M. bovis,对其他病原均无交叉反应,特异性强;分别以10倍倍比稀释(1.2×10^(4)拷贝/μL~1.2×10^(-2)拷贝/μL)后的重组质粒标准品pMD19-T-uvrC为模板,进行敏感性试验,结果显示该ddPCR方法的检测下限为1.2拷贝/μL,是荧光定量PCR方法敏感性的10倍,该ddPCR敏感性高;对该ddPCR进行组内和组间重复性试验,结果显示其组内和组间变异系数均小于5%,重复性好。取23份来自患有乳房炎奶牛的新鲜牛奶和40份来自有呼吸道症状的牛鼻拭子样品,分别通过ddPCR、病原分离鉴定和荧光定量PCR方法检测M. bovis,结果显示,阳性率分别为42.86%(27/63)、33.33%(21/63)和33.33%(21/63),该ddPCR敏感性高于病原分离鉴定和荧光定量PCR方法,ddPCR方法与上述两种方法的符合率均为62.9%。本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强,可对牛支原体进行定量检测,为牛支原体感染的早期监测和精准检测提供了可行技术手段。