摘要：【目的】试验旨在对布鲁氏菌分泌蛋白BspI进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得BspI蛋白并制备其多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】使用在线软件对BspI蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,参照布鲁氏菌16M株BspI基因序列(GenBank登录号:DK63_1233)设计引物,PCR扩增目的基因后连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆,将目的基因连接到pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导蛋白表达,并进行SDS-PAGE分析,用镍柱亲和层析方法纯化蛋白,纯化后的蛋白与弗氏佐剂混合免疫试验兔,采血分离血清,通过Western blotting、间接ELISA法进行多克隆抗体特异性及抗体效价分析。【结果】BspI蛋白为不稳定亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽区域,有13个磷酸化位点和7个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。PCR成功扩增出675 bp的BspI基因,成功构建了pET-28a-BspI表达载体。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达出25.3 ku的蛋白,纯化后无明显杂带,制备的多克隆抗体能够特异性地与BspI蛋白结合。间接ELISA结果显示,BspI蛋白多克隆抗体效价为1∶409600。【结论】制备的兔源BspI蛋白多克隆抗体可以特异性识别BspI蛋白,该蛋白具有较好的反应原性。试验结果为进一步研究BspI蛋白在布鲁氏菌的胞内寄生中发挥的作用提供了参考。

摘要：【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX 1基因序列(登录号:XM_021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX 1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS(对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋白的表达水平;使用生物信息学软件预测DDX1蛋白的磷酸化位点;免疫沉淀试验检测PEDV感染IPI-2I细胞12 h后DDX1的磷酸化水平。【结果】PCR成功扩增得到大小为2223 bp的DDX 1目的基因条带。双酶切鉴定结果显示,成功构建pMD19-T-DDX1克隆载体和pcDNA3.1-DDX1真核表达载体。与PBS组相比,转染pcDNA3.1-DDX1的细胞DDX1蛋白表达水平极显著上升(P<0.01),表明DDX1转染成功。间接免疫荧光试验结果显示,与PBS组相比,PEDV感染组中出现大量绿色荧光信号,表明PEDV感染IPI-2I细胞模型构建成功;与PBS组相比,PEDV N蛋白的荧光信号明显减少,PEDV N基因mRNA表达水平及蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析发现,DDX1蛋白具有多个磷酸化位点,其中包括17个丝氨酸、12个苏氨酸及6个酪氨酸。免疫沉淀试验结果显示,与未感染组相比,PEDV感染组中DDX1磷酸化水平极显著上升(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了pcDNA3.1-DDX1真核表达载体,发现PEDV感染IPI-2I细胞12 h后,DDX1抑制了PEDV的复制,升高了磷酸化水平,说明DDX1在PEDV感染期间可能通过磷酸化抑制PEDV的复制。

摘要：【目的】试验旨在研究长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viru,PEDV)感染非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)过程中对自噬的调控作用,以期为抗PEDV新型药物靶点的开发提供新思路。【方法】根据GenBank上公布的人lncRNA-HOTAIR基因序列(登录号:NR_047517.1),利用LongMan在线工具筛选lncRNA-HOTAIR的猴源同源序列(lncRNA-M),并利用RNAfold、LncLocator在线预测工具预测其二级结构和核质分布。建立PEDV感染的Vero-E6细胞模型,在0、6、12、24、36和48 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测微管相关蛋白1-轻链3(LC3)蛋白的表达,以明确病毒感染细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR检测lncRNA-M在PEDV感染Vero-E6细胞模型中0、6、12、24、36和48 h的表达水平。设计并合成3条lncRNA-M的干扰片段:siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3,分别转染Vero-E6细胞,待细胞汇合度达到90%时接毒,感染48 h后利用实时荧光定量PCR检测lncRNA-M的表达情况,筛选出干扰效率最高的干扰片段。将干扰效率最高的干扰片段转染至Vero-E6细胞并接种PEDV后,通过Western blotting检测感染后24和48 h LC3蛋白的表达水平,以验证自噬的发生情况。【结果】成功筛选出lncRNA-HOTAIR猴源同源序列为lncRNA 0.1,并根据RNAfold预测结果生成lncRNA 0.1的RNA最小自由能二级结构;LncLocator预测结果表明,lncRNA 0.1在细胞核和细胞质中的分布分别为41.88%和37.78%。PEDV感染Vero-E6细胞48 h后,细胞皱缩、聚集成团,细胞膜融合形成合胞体;1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示,在1326 bp处出现目的条带,说明PEDV感染Vero-E6细胞模型成功建立。在PEDV感染的Vero-E6细胞模型中,Western blotting结果显示,6、12、24、36和48 h LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在48 h最高且极显著高于0 h(P<0.01);实时荧光定量PCR结果显示,LC3的mRNA表达量在48 h最高,且极显著高于0 h(P<0.01),自噬被激活;lncRNA 0.1的表达均呈上升趋势,在48 h表达量最高,48 h lncRNA 0.1的表达量极显著高于0 h(P<0.01);siRNA-2的干扰效果最好,干扰效率为80%。干扰lncRNA 0.1后,Western blotting结果显示,24和48 h干扰组的LC3蛋白表达量均低于对照组,自噬受到抑制。【结论】PEDV感染Vero-E6细胞能够诱导自噬发生,lncRNA 0.1在感染过程中起到了促进自噬的作用。

摘要：[目的]研究汉赛巴尔通体(Bartonella henselae,Bh)P26蛋白的抗原特性。[方法]根据GenBank中Bh P26基因DNA序列设计特异性引物,对阳性猫血液样品进行PCR扩增,克隆测序后进行分子特征分析。构建表达载体pETP26,转化至感受态细胞*** BL21(DE3)进行诱导表达;将重组蛋白纯化后免疫小鼠,用间接ELISA抗体检测试剂盒检测抗体,分析其免疫学特性。[结果]P26基因全长738 bp,编码246个氨基酸。推导的P26蛋白氨基酸序列含有4个潜在的N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N-豆蔻酰化位点和1个信号肽序列;抗原表位主要集中在106~190位。SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,表达的分子量为35 kDa,可与B h阳性血清发生反应;重组蛋白免疫小鼠后其血清样本Bh抗体检测结果为阳性。[结论]P26重组蛋白在大肠杆菌的高效表达且具有良好的反应和免疫原性,为进一步探讨P26蛋白在Bh感染诊断研究中的潜在价值提供前期基础。

摘要：【目的】本文构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)HSP20基因的重组表达载体并表达、纯化重组蛋白,研究其反应原性。【方法】根据Gen Bank中Eg HSP20蛋白基因c DNA序列设计特异性引物,以细粒棘球蚴Eg头节总RNA为模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆至p MD19-T载体,测序验证后,将Eg HSP20抗原基因亚克隆至表达载体p ET-32a中,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行纯化及反应原性分析。【结果】Eg HSP20 c DNA全长945个核苷酸,编码314个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,5个PKC磷酸化位点,10个CKⅡ磷酸化位点;抗原表位区集中在39~53位和120~168位。SDS-PAGE检测显示,重组菌可表达分子量为51 k Da的重组蛋白;Western blot结果显示,表达的重组蛋白Eg HSP20抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应。【结论】证实Eg HSP20蛋白具有较强的反应原性,为进一步利用Eg HSP20重组蛋白作为Eg感染诊断中候选标识分子奠定了前期基础。

摘要：为了通过慢病毒感染的方法建立 pre-miR-29b 表达的 Balb /c 小鼠模型,从而研究 miR-29b在动物模型体内过表达对牛病毒性腹泻病毒( Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染和复制的影响,试验根据 miRBase 数据库中牛 miR-29b 前体 pre-miR-29b 序列设计引物,以 MDBK 细胞全基因组DNA 为模板,PCR扩增 pre-miR-29b 基因,并克隆至空质粒 pLL3.7 中;共同转染 pLL3. 7-pre-miR-29b 及慢病毒包装辅助质粒( pRSV-Rev、pCMV-VSVG 和 pMDLg/pRRE)至 HEK-293T 细胞中,于48,72 小时时收集病毒液,浓缩后接种至 HEK-293T 细胞中进行慢病毒效价测定。将6只 Balb/c小鼠平均分成2组,即空质粒 pLL3.7 感染组和慢病毒 pLL3.7-pre-miR-29b 感染组,每只小鼠尾静脉注射5.0×10^7 infection units(IU)/mL 病毒液,于注射后96小时时处死小鼠,采集肝脏、脾脏、肾脏等器官,提取总 miRNA,并反转录成 cDNA,使用TaqMan 荧光定量RT-PCR法检测 miR-29b 在小鼠不同器官中的表达情况。结果表明:试验成功扩增得到牛 pre-miR-29b 并构建出 pLL3.7-pre-miR-29b;成功包装 pLL3.7-pre-miR-29b慢病毒,其效价为 5.8×10^8 IU /mL;经尾静脉注射慢病毒后,在慢病毒pLL3.7-pre-miR-29b 感染的小鼠不同器官中均有较高水平的 miR-29b 表达。说明试验成功建立了慢病毒介导牛 pre-miR-29b表达的 Balb/c小鼠模型。

摘要：为明确绵羊细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,TP_x)蛋白的反应原性,并进一步利用Eg TP_x重组蛋白作为Eg感染诊断中的候选标识分子奠定基础,根据GenBank中Eg TP_x基因的cDNA序列设计特异性引物,以Eg头节为总RNA模板,进行RTPCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体,经测序验证后亚克隆至表达载体pET-32a中,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对表达的重组蛋白进行纯化及反应原性分析。结果表明:Eg TP_x cDNA全长为582个核苷酸,编码193个氨基酸。该多肽含有1个N端糖基化位点,1个N端酰基化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)磷酸化位点,4个蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点;抗原表位区集中在58~94位和160~188位。重组菌可表达分子量为37ku的重组蛋白,重组蛋白Eg TP_x抗原能与Eg阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。