摘要：目的筛选布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞过程中与Ⅳ型分泌系统VirB4蛋白结合的潜在靶蛋白。方法设计引物并PCR扩增布鲁氏菌的virB4基因,构建表达载体pGBKT7-VirB4,酶切鉴定,测序分析正确后,转化酿酒酵母菌感受态细胞Y187,进行自激活和毒性检测;建立布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞模型,构建布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;采用酵母双杂交技术筛选与VirB4相互作用的滋养层细胞蛋白,实时定量PCR检测靶蛋白表达量的变化。结果成功构建了pGBKT7-virB4诱饵质粒,转入Y187后无毒性,不能自激活;获得了布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;筛选到了13个阳性质粒,其中蛋白辅酶Q10和SLC3A2在布鲁氏菌侵染后mRNA表达量均增加。结论本试验对VirB4蛋白与宿主细胞的互作研究为进一步阐明布鲁氏菌感染宿主细胞的发病机制奠定了基础。

摘要：为研究结核杆菌毒力因子CFP10在结核杆菌感染细胞过程中的功能,本研究根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的CFP10基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到CFP10基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将CFP10基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-CFP10,分别转染293T细胞和U937细胞。经western blot分析表明CFP10-EGFP融合蛋白在293T细胞和U937细胞中均获得了表达。通过激光共聚焦显微镜观察显示在293T细胞和U937细胞,CFP10-EGFP融合蛋白主要分布于细胞质。本研究为进一步研究毒力因子CFP10在感染宿主细胞中的作用奠定了基础。

摘要：目的通过实时定量PCR(real-ti me PCR)检测基因表达的mRNA,建立一种直接观察小干扰RNA(si RNA)抑制目的基因表达的方法。方法化学设计合成对应于FTH1(ferritin heavy chain1,FTH1)基因表达mRNA的si RNA,经TurboFectTMin vitro Transfection Reagent转染小鼠RAW264.7巨噬细胞,48h后,提取总RNA,逆转录为cDNA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,定量检测FTH1的表达,比较干扰前后FTH1基因mRNA的量。结果 3种si RNA处理的小鼠巨噬细胞中FTH1基因的表达抑制率最高为97.60%。结论实时定量PCR方法的建立为研究布鲁氏菌在侵染巨噬细胞过程中FTH1的功能提供了有效途径。

摘要：为建立一种快速、高敏感、高特异、鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,本研究根据大多数致病性结核分枝杆菌共有序列esat-6,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌gyrB共有特异性序列,以及结核分枝杆菌种特异序列mtp40设计6对特异性引物对痰液中的结核分枝杆菌进行检测,并与鉴别培养基分离培养结果以及常规PCR鉴定结果进行比较。实验结果表明,建立的LAMP检测方法具有很高的特异性。可区分致病性结核分枝杆菌和非致病结核分枝杆菌,也可鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右,可检测到7拷贝/反应。另外,用3种方法同时检测样品发现,LAMP与细菌培养的符合率为90.91%,LAMP与常规PCR检测结果的符合率为100%。LAMP检测方法可以在流行病学调查及现场快速诊断方面广泛应用,并为临床治疗提供依据。

摘要：目的:克隆新疆地区奶牛il-6基因,获得原核表达IL-6蛋白。方法:根据GenBank上牛IL-6的序列,用premier5.0软件设计一对引物。以牛肺巨噬细胞提取的RNA反转录产物(cDNA)为模板扩增出567bp的条带,克隆到pBS-T载体,测序正确后,提取质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切回收目的条带,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化DE3菌,经IPTG诱导表达。以表达产物免疫小白鼠血清为一抗检测表达产物的反应原性。结果:成功克隆了新疆地区奶牛il-6基因,克隆部分编码188个氨基酸与GenBank公布的序列100%同源,表达出46kDa的融合蛋白,免疫印迹检测显示原核表达牛IL-6有免疫原性。结论:新疆地区奶牛在IL-6的基因序列上与其他地方牛无差异,原核表达奶牛IL-6蛋白为在奶牛乳房炎疫苗中的佐剂效果研究打下了基础。

摘要：背景结核病是世界范围内单一致病菌感染导致死亡率最高的慢性感染性疾病,目前缺乏安全有效的疫苗预防成人结核病。而预防接种主要是利用机体具有免疫记忆的特征以阻止病原体的再次入侵,因此,研究T淋巴细胞的免疫记忆及增殖能力对新型结核病疫苗的设计至关重要。目的探讨新型结核病疫苗菌株(简称B/R菌株)对T淋巴细胞免疫记忆及增殖能力的影响。方法2019年1月,选取6~8周龄、SPF级雌性C57BL/6小鼠48只,随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、卡介苗(BCG)组、结核分枝杆菌国际标准毒株(H37Ra)组和新型结核病疫苗(B/R)菌株组,各12只。PBS组、BCG组、H37Ra组和B/R菌株组分别皮下接种PBS、BCG、H37Ra和B/R菌株。4组分别于免疫后8周、12周、16周各取3只小鼠提取脾淋巴细胞体外刺激培养,利用流式细胞技术检测中央型记忆性淋巴细胞(TCM)及效应型记忆性淋巴细胞(TEM),酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脾淋巴细胞分泌的抗原特异性Th1/Th2型细胞因子[白介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)]水平;羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记法检测CD4+T淋巴细胞增殖率、CD8+T淋巴细胞增殖率。结果免疫后8、12、16周BCG组、H37Ra组、B/R菌株组CD4+的TCM和TEM高于PBS组(P<0.05);免疫后8周B/R菌株组CD4+的TEM低于H37Ra组(P<0.05);免疫后16周B/R菌株组CD4+的TCM高于H37Ra组和BCG组(P<0.05);免疫后16周B/R菌株组CD4+的TEM高于BCG组(P<0.05)。免疫后8、12、16周BCG组、H37Ra组、B/R菌株组CD8+的TCM和TEM高于PBS对照组(P<0.05);免疫后12周B/R菌株组CD8+的TEM高于H37Ra组和BCG组(P<0.05);免疫后16周,B/R菌株组CD8+的TCM和TEM高于BCG组(P<0.05)。免疫后8、12、16周PBS组IL-2和IFN-γ低于BCG组、H37Ra组、B/R菌株组(P<0.05);免疫后12周,B/R菌株组IFN-γ高于BCG组(P<0.05);免疫后16周,B/R菌株组IFN-γ和IL-2高于BCG组和H37Ra组(P<0.05)。BCG组、H37Ra组和B/R菌株组CD4+T淋巴细胞增殖率、CD8+T淋巴细胞增殖率高于PBS组(P<0.05);B/R菌株组的CD4+T淋巴细胞增殖率、CD8+T淋巴细胞增殖率均高于BCG组和H37Ra组(P<0.05)。结论B/R菌株免疫小鼠后,可促进机体产生更高水平的免疫保护性记忆细胞,以Th1型细胞免疫应答为主,并可增强T淋巴细胞增殖能力。

摘要：牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhoea virus,BVDV）不同的基因型在抗原性方面存在差异,使疫苗免疫难以收到预期效果。本试验对分离到的BVDV石河子株和其他石河子分离株进行基因型鉴定,通过对病毒的遗传分类研究,为该病的防治和开发新的基因工程疫苗提供一定依据。采用免疫学试验、电镜观察、理化特性测定以及PCR技术、同源性比较等方法分离、鉴定1株BVDV石河子分离株,命名为BVDV shz132株,并应用系统发生分析方法鉴定该株与其他石河子分离株Manasis、hihezi148和Letuyi株的基因型。将免疫学鉴定为阳性的样品进行病毒分离,电镜观察分离的BVDV shz132株病毒直径为40~60 nm,为有囊膜的球形颗粒。理化鉴定结果与参考株BVDV Oregon C24V一致。根据BVDV基因组5-′UTR基因设计引物在发病牛淋巴结、肠道分泌物制备的悬液及其分离的病毒细胞培养物中均扩增得到了大小为267 bp的片段。核苷酸同源性分析结果表明BVDV shz132株与BVDV Osloss株的同源性最高（97.5%）,BVDV Manasi株等与BVDV NADL株的同源性最高（97.8%）;系统发生分析表明上述所有石河子分离株均属于BVDV-Ⅰ型。

摘要：结核分枝杆菌是一种胞内感染菌,巨噬细胞是其寄生场所。巨噬细胞是机体内抗菌免疫的主要效应细胞,通过直接杀伤和/或分泌多种细胞因子,对结核分枝杆菌具有抗原呈递、免疫杀伤等作用;结核分枝杆菌则可通过阻止吞噬体与溶酶体的融合逃避巨噬细胞的免疫监视和攻击。深入研究结核分枝杆菌对巨噬细胞免疫杀伤和免疫逃避机制,对研究宿主抗结核免疫机制以及设计新型结核病疫苗有深远意义。

摘要：目的运用实时定量PCR(Real-time PCR)检测结核分枝杆菌耐异烟肼菌株和敏感株Ag85B、38kDa及MPT64编码基因(fbpB、psts1、mpt64)的mRNA表达水平,探讨结核分枝杆菌耐异烟肼株和敏感株的蛋白抗原在转录水平的差异性。方法根据GenBank提供的序列,设计目的基因fbpB、psts1、mpt64及内参基因Sigа的特异引物,将fbpB、psts1、mpt64及Sigа扩增片段克隆入载体pMD18-T simple,重组质粒经纯化及倍比稀释,应用SYBR GreenⅠ荧光染料建立检测fbpB、psts1、mpt64的实时定量PCR方法,并应用此方法检测22株耐异烟肼菌株及25株敏感菌株(含H37Rv标准株)中fbpB、psts1、mpt64的mRNA表达水平。结果耐异烟肼菌株的fbpB表达水平为0.65±0.22,敏感菌株的表达水平为0.36±0.13,两者有显著性差异(t=5.683,P0.05)。结论成功建立了fbpB、psts1、mpt64基因的实时定量检测方法,检测显示耐异烟肼菌株的fbpB、psts1基因的mRNA表达水平显著高于敏感菌株,可能为耐异烟肼MTB的实验室诊断提供分子标识。

摘要：【目的】克隆抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)中淀粉合成酶关键基因SBEⅡa和SBEⅡb进行多态性分析,从分子水平阐述不同小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因。【方法】根据Gene Bank中公布的小麦SBEⅡa(AF286319.1)和SBEⅡb(AY740401.1)基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡa和SBEⅡb基因序列,利用Clustal.W进行测序结果的比对分析,NCBI Conserved domain和inte Pro在线网站对SBEⅡa和SBEⅡb氨基酸序列进行结构域预测,寻找影响抗性淀粉含量的主效基因位点。【结果】克隆了SBEⅡa(2 471 bp)、SBEⅡb(2 510 bp)基因ORF(open reading frame,ORF)全长。序列分析表明:SBEⅡa、SBEⅡb基因与公布的序列同源性分别为98.64%和99.07%。【结论】SBEⅡa基因ORF的三个结构域中未发现影响籽粒抗性淀粉含量的候选差异位点。在SBEⅡb基因编码区羧基C-末端的3个候选差异位点和α-淀粉催化酶结构域的1个候选差异位点可能是造成小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因。SBEⅡa、SBEⅡb氨基N-末端前面序列中共计10个单碱基变异作为潜在差异位点,也可能参与SBE基因的表达。