摘要：设计并合成针对人MEKK2基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,将合成的互补片段退火后克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,并使其在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒。病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western blot印迹法检测其对MEKK2表达的抑制。经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误。Western blot印迹检测结果显示,重组腺病毒表达载体可抑制MEKK2基因的表达,以pAd-MEKK2-siRNA2(针对MEKK2 cDNA 992-1 010的片段)抑制效果为最佳,pAd-MEKK2-siRNA1(针对MEKK2 cDNA 1 456-1 474的片段)和pAd-MEKK2-siRNA3(针对MEKK2 cDNA 1 351-1 369的片段)则未见明显的抑制效果。DNA Ladder和细胞存活测定结果表明,敲减MEKK2的表达后,AGS细胞接受H2O2刺激后的凋亡受到较强抑制、细胞存活数增加,明显高于野生型细胞和转导siRNA阴性对照腺病毒细胞接受H2O2刺激后的,差异具有统计学意义(P0.05)。该研究成功地构建了针对MEKK2基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步深入研究MEKK2基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础。

摘要：研究AKT2基因对H2O2诱导的乳腺癌细胞凋亡的影响.RT-PCR扩增人AKT2基因全长cDNA序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,构建AKT2基因的真核表达载体(野生型,WT-AKT2);应用QuikChange定点诱变,制备AKT2激酶活性丧失的负性表达载体(DN-AKT2).WT-AKT2和DN-AKT2分别转染人乳腺癌MCF-7细胞,新霉素筛选稳定转染细胞克隆;设计并合成针对人AKT2基因2个不同部位的siRNA片段,转染入同样的细胞.通过TUNEL和DNA ladder测定,研究转染AKT2基因及AKT2 siRNA前后细胞对H2O2诱导凋亡的抵抗作用.测序鉴定证实,WT-AKT2和DN-AKT2表达载体构建成功.Western印迹结果显示,WT-AKT2和DN-AKT2基因在MCF-7细胞中表达良好,而AKT2 siRNA则可有效地抑制AKT2的表达;TUNEL和DNA ladder测定结果表明,WT-AKT2表达上调的稳定克隆组,可显著提高MCF-7细胞对H2O2诱导的凋亡的抵抗作用(转染DN-AKT2具相反作用).经H2O2作用后,其凋亡细胞数显著低于空载体稳定转染克隆及未转染亲代细胞的,差异具有统计学意义(P0.05).AKT2抑制乳腺癌细胞对H2O2诱导凋亡的作用可被AKT2 siRNA和PI3K/AKT信号途径抑制剂wortmannin所阻断.内源性的结果进一步证明了AKT2的功能.本研究表明,AKT2能够抑制H2O2诱导的MCF-7人乳腺癌细胞凋亡,可能成为乳腺癌治疗的靶点之一,并为研究乳腺癌细胞抵抗活性氧诱导的细胞凋亡的分子机制奠定了基础.

摘要：当前，自动化的血液及尿分析仪在我国已相当普及，它不仅大大提高了临床检验的效率，减轻劳动强度，促进了检验方法的标准化和结果的可比性，而且在一定程度上也提高了检验的精密度和准确性。这类仪器的显著特点之一是，将原先要在显微镜下辨认或计数的细胞，改变为根据细胞的大小、内部和表面结构、加入特殊试剂（如溶血剂、细胞化学试剂和染色剂等）后细胞的变化，用测量其电阻、对高频电磁波的传导性、在不同角度测细胞对光的散射程度以及用光度计测定颜色变化等光学和电学方法，直接或间接地加以计数和区分。虽然这些方法的设计都是有理论根据，并历经数十年的研究、改进和实际应用的考验，认为方法已成熟，所开发的仪器及配套试剂经过法定机构（如美国的FDA）批准后才进入市场的，但它们毕竟不是在显微镜下直接观察细胞，在有些情况，特别有病理条件下，其测定结果并不可靠或难以确定，还需要在显微镜下进行复检（review），这是经过多年实践后的一致看法，并且也是产品监控机构以及所有仪器厂家所承认并要求做到的。因此说，这类仪器仅仅是一种过筛性质的仪器。

摘要：目的　构建并表达抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体 ,观察其生物学活性及临床意义。方法　利用PCR方法及分子生物学基因克隆技术 ,构建抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体融合基因 ,测序正确后 ,利用EcoRI和HindⅢ酶切位点 ,将融合基因亚克隆入真核表达载体进行表达 ,表达产物纯化后 ,利用流式细胞仪进行生物学活性测定。结果　经酶切、测序分析证实插入的基因片段大小为 1 5kb ,序列与设计完全一致 ;SDS PAGE和Western印迹实验证明 :表达产物分泌于细胞培养上清 ,相对分子质量为 6 10 0 0 ;流式细胞仪结果显示 :双特异性单链抗体与PBMC和PC 3细胞的阳性结合率分别为 5 4 1%和 5 3 7%。结论　抗前列腺癌 /抗人CD 3双特异性单链抗体具有较好的生物学活性 ,为进一步的体内实验奠定了基础。

摘要：背景女性压力性尿失禁的患病率随着年龄的增加而增加,患病率各国调查研究很不一致。国内尿失禁流行病学研究较少,定义、诊断标准和设计不尽一致。目的对女性压力性尿失禁进行流行病学调查,为女性尿失禁的各方面研究提供准确资料。设计女性尿失禁流行病学研究,综述性文献。对象和方法分析患有压力性尿失禁的各国妇女流行病学调查资料。主要观察指标女性压力性尿失禁的发病率、发病的相关因素及生活质量的评估。结果尿失禁患病率与尿失禁的定义不同有关。调查方法的不同也影响患病率的结果,单纯问卷调查患病率高于问卷结合体检患病率。结论尿失禁的发病与年龄、性别、分娩、肥胖、绝经等多种因素有关,严重尿失禁患者影响生活质量。

摘要：目的构建小鼠精子特异性乳酸脱氢酶C4(mLDHC4)的原核表达载体并进行重组蛋白的纯化。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,反转录合成cDNA。自行设计引物,PCR扩增mLDHC4的编码序列,产物经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后,克隆至表达载体pET-28a(+)中,获得重组载体。将重组载体转化大肠杆菌***21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导mLDHC4表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和乳酸脱氢酶活性测定方法对重组mLDHC4进行鉴定,Ni+-NTA亲和层析法纯化mLDHC4,并将其与pVAX1-mLDHC4(小鼠mLDHC4的真核表达载体)免疫小鼠的抗血清进行免疫印迹反应。结果重组载体经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后,可释放大小约1000bp的插入片段,序列分析表明,克隆的DNA片段与GenBank登录的mLDHC4编码序列完全一致,将此重组质粒命名为pET-28a(+)-mLDHC4。在IPTG的诱导下,重组菌可表达大小约35kD的蛋白质,且其裂解液具有很高的乳酸脱氢酶活性,经亲和层析纯化后在聚丙烯酰胺凝肢中仅显示单一蛋白区带,与抗血清反应后在硝酸纤维素膜上形成特异性条带。结论小鼠mLDHC4的全长编码序列已被克隆至原核表达载体pET-28a(+)质粒,并在***21(DE3)中获得高效表达,纯化后的蛋白特异性高、活性强。

摘要：目的 对17α羟化酶17,20碳链裂解酶缺陷症（17OHD）1个家系4人进行分子诊断。方法 对2013年南京军区福州总医院收治的17OHD患者及其母亲、小姨和妹妹全血中抽提基因组DNA,设计8对引物,采用PCR扩增产物直接测序方法进行基因突变分析。结果 先证者的临床表现符合17OHD,其家族中未有其他病例。先证者序列分析表明,其CYP17A1基因第8外显子存在9个碱基（GACTCTTTC）缺失,导致第487-489位氨基酸缺失,使P450c17酶完全失活,从而导致17OHD。其母亲和小姨为该位点杂合缺失,妹妹未检测到同一缺失。结论 建立了基于CYP17A1基因突变分析的分子诊断方法,可以对17OHD进行准确的分子诊断,并可为遗传咨询及其产前诊断奠定基础。

摘要：目的探讨临床应用前臂后外侧中段穿支皮瓣修复前臂下段背侧皮肤缺损的可行性。方法通过对30侧尸体红色乳胶灌注进行解剖，研究前臂后外侧中段穿支皮瓣血供的起源、走行、分支、外径、分布及其吻合情况，在前臂后外侧设计切取前臂后外侧中段穿支皮瓣，转移修复前臂下段背侧皮肤缺损8例。结果8例前臂后外侧中段的穿支皮瓣全部成活，创面一期愈合，获2—28个月随访，皮瓣色泽接近正常，质地和外形良好。结论前臂后外侧中段穿支皮瓣是一血管相对恒定，血供丰富的非主干血管为蒂的轴型皮瓣，是修复前臂下段背侧缺损创面的理想方法之一。

摘要：选择2003-02/2007-02于福州总医院骨科应用胫后动脉穿支筋膜蒂皮瓣移植修复小腿皮肤软组织缺损的患者16例,在解剖学基础上,设计胫后动脉穿支筋膜蒂皮瓣,轴线在胫骨内侧髁后与内踝、跟腱间中点的连线,旋转点在最邻近创面、其蒂部在有胫后动脉穿支的轴线上。根据术前超声多普勒血流仪穿支探测,要求皮瓣、蒂部及穿支表面有良好的皮肤。顺行设计皮瓣修复小腿上段,逆行设计修复小腿中下段,其中小腿下段9例,小腿中段3例,小腿上段4例。皮肤软组织缺损范围为2.0cm×1.5cm～12.5cm×7.5cm,胫后动脉穿支筋膜蒂皮瓣最大面积为15.0cm×10.0cm,最小为4.0cm×2.5cm。观察其修复效果。术后皮瓣均成活。有2例远端部分皮肤坏死,但其皮下有肉芽生长,其中1例经换药愈合,1例用中厚皮植皮愈合。所有病例均随访半年以上,患肢正常步态行走,有痛觉。应用胫后动脉穿支筋膜蒂皮瓣移植修复小腿皮肤软组织缺损,供区在小腿内后侧,损伤后蒂部保存良好,切取便利,不损伤主要血管,血供可靠,成活率高,是修复小腿皮肤软组织缺损的首选术式之一。

摘要：目的:探索经载体介导的RNA干涉对肝癌细胞cmyc基因表达抑制的可行性。方法:设计并合成2条靶向癌基因cmyc的RNA干涉模板片段,分别将其连接至pSilencer1.0U6载体上构建siRNA真核表达载体;脂质体转染法将上述重组质粒转入BEL7402肝癌细胞株。半定量RTPCR分析cmyc基因的表达抑制效率,以及cmyc基因表达下调细胞中CDK4、hTERT和Gadd45β基因表达的改变。结果:获得2个能在细胞内有效转录生成靶向cmyc基因siRNA的重组载体pSicmyc1和pSicmyc2;其中pSicmyc2可有效介导肝癌细胞BEL7402cmyc基因的表达抑制,抑制率高达90%以上;在cmyc基因经RNAi抑制的细胞中,CDK4和hTERT基因的表达分别下调至85%和57%;而Gadd45β的表达上调约110%。结论:肝癌细胞BEL7402中cmyc基因的表达可被载体介导诱发的RNA干涉有效抑制,进而导致细胞中与增殖和凋亡相关基因的表达改变。