摘要：热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides ***, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum ***, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

摘要：禽腺病毒属成员鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)和禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是养殖场主要流行的病原,对养禽业造成巨大的经济损失。目前尚未见可同时快速检测这2种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于DAdV-3 GDMM10毒株和FAdV-4 GDMZ毒株Fiber2基因序列比对及遗传进化分析,分别在Fiber2基因保守区设计特异性引物,建立了能同时鉴别临床上常见的DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,DAdV-3 GDMM10和FAdV-4 GDMZ Fiber2基因处于两个不同进化分支上,同源性为46.10%。建立的检测DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,最低可检出45拷贝/μL的DAdV-3样品和17拷贝/μL的FAdV-4样品;且检测结果可直接通过Tm值差异进行判定,简化操作时间。利用该双重荧光定量PCR方法对2022年度临床上采集的34份肝炎-心包积液疑似样品进行检测,DAdV-3和FAdV-4检出率分别为17.65%和2.94%。为进一步开展禽源DAdV-3和FAdV-4的分子流行病学及共感染致病机制奠定了基础。

摘要：试验旨在研究低蛋白日粮中添加复合酶对白羽肉鸡生长性能、血清生化和抗氧化指标、免疫功能和消化器官的影响。将288只1日龄白羽肉鸡随机分为6组,试验期42 d,试验配方设计1~21日龄和22~42日龄两阶段。对照组(CK组)饲喂常规蛋白日粮(两阶段粗蛋白水平分别为21.28%和19.04%);试验组均饲喂低蛋白日粮(两阶段粗蛋白水平较CK组分别降低0.97%和0.94%),试验1、2、3组全程分别添加200 mg/kg复合酶A(T1组)、200 mg/kg复合酶B(T2组)、300 mg/kg复合酶B(T3组),试验4组两阶段分别添加复合酶B 100、300 mg/kg;另设低蛋白日粮组(T0组)。试验结束时进行生长性能、血清生化和抗氧化指标、免疫功能和消化器官发育情况的测定分析。结果表明:T2、T3组21日龄活体重、42日龄活体重和欧洲生产效率指数均较高,T3组1~42日龄料重比低于其他组;CK组和T3组血清中尿素(UREA)含量显著低于T4组(P<0.05),T2组血清谷草转氨酶(AST)活性显著高于T1组外的其他组(P<0.05),T0、T1和T2组血清超氧化物歧化酶(SOD)含量显著低于T4组(P<0.05);T4组IgA、IgG和IgE显著高于T0组(P<0.05)。综上所述,在低蛋白日粮中添加复合酶能够提高白羽肉鸡指标和抗氧化能力,促进免疫器官和消化器官发育,提高免疫力。

摘要：为了提高发酵豆渣在肉用山羊中的利用效率,本研究测定分析了发酵豆渣的常规营养成分含量,并开展了其在不同肉用山羊品种的消化代谢试验。试验以山羊品种和发酵豆渣添加水平为分析因素,采用双因素3×4随机区组设计,选取体况良好3个品种肉羊[努比亚山羊,体重(15.40±1.23)kg;闽东山羊,体重(15.38±1.32)kg;福清山羊,体重(15.46±1.27)kg]生长期羯羊各24只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复1只羊。各组分别饲喂基础饲粮(对照组,CON组)以及添加10%(FSR10组)、20%(FSR20组)和30%发酵豆渣(FSR30组)的试验饲粮。预试期10 d,正试期7 d。结果表明:1)发酵豆渣的总能(GE)为16.07 MJ/kg,粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗灰分(Ash)、钙和磷含量分别为17.06%、52.81%、24.10%、3.40%、0.44%和0.18%。2)山羊品种和发酵豆渣添加水平的交互作用对干物质采食量(DMI)、平均日增重(ADG)、始重(IBW)和末重(FBW)的影响均不显著(P>0.05),而山羊品种和发酵豆渣添加水平均显著影响DMI和ADG(P0.05);发酵豆渣添加水平显著影响DM、OM、CP、GE、NDF和ADF的全肠道表观消化率(P0.05)。FSR10组的氮利用效率优于其他各组,闽东山羊对饲粮中氮利用效率优于福清山羊和努比亚山羊。由此可见,山羊品种和发酵豆渣添加水平均能影响发酵豆渣的消化、吸收和利用;在体重一致的条件下,闽东山羊对发酵豆渣的氮消化利用能力优于努比亚山羊;育肥山羊饲粮中发酵豆渣的添加水平以10%~20%为宜。

摘要：【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法,为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列,利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测BRV的RT-PCR方法,同时开展了特异性、敏感性和重复性试验,并将建立的方法应用于22份临床样品的检测。【结果】建立的方法仅能够扩增出BRV的特异性片段,对其他畜禽常见病原体无特异性扩增;该方法的灵敏度为6.86×10^(5)copies·μL^(-1)。对22份临床样品进行检测,检测出12份阳性样品,阳性率为54.55%。【结论】本研究建立的BRV RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床样本的检测,为福建省BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

摘要：【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF87基因,分析其序列特征并制备多克隆抗体,为揭示ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的ORF87基因序列设计引物,从AngHV-FJ株基因组中扩增出ORF87基因,构建重组质粒pMD19-ORF87经酶切鉴定和测序验证后,采用Softberry、ProtParam、CDD、TMHMM、SignalP 5.0、PSORT及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;将ORF87基因克隆至p ET-32a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定;以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备ORF87多克隆抗体。【结果】克隆获得的AngHV-FJ株ORF87基因为2127 bp,与GenBank已发布的参考序列高度同源(相似性为99.72%),仅存在4个碱基突变;其编码蛋白分子量为80.1 kD,理论等电点(pI)为7.62,不稳定系数为42.38,总平均亲水性为-0.271。ORF87蛋白具有蛋白激酶C超家族(PKC-like Superfamily)的保守结构域,但不具信号肽和跨膜结构域;其亚细胞定位可能位于细胞核和细胞质膜,存在19个潜在B细胞抗原表位,即具有良好的免疫原性。AngHV-FJ株ORF87基因可在大肠杆菌中高效表达,表达获得的融合蛋白约100.0 kD,主要以包涵体形式存在;以融合蛋白免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体效价达1∶16000,能特异性识别AngHV的ORF87蛋白。【结论】AngHV-FJ株源ORF87基因经原核表达载体诱导表达获得的融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性,以其免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体具有高效价,能特异性识别AngHV感染,可作为亚细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用。

摘要：【目的】旨在建立一种检测鸭骨形态发生蛋白(BMPs)mRNA转录水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RTPCR检测方法。【方法】根据GenBank中BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15的核苷酸序列设计并合成特异性引物进行PCR扩增,产物回收后克隆至pMD-18-T载体,构建阳性重组质粒作为标准品,优化SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件,建立其标准曲线,对建立的方法进行特异性、敏感性和重复性试验。【结果】建立的BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15基因实时荧光定量检测方法特异性强,无引物二聚体及非特异性产物,熔解曲线为单峰,相关系数R2均大于0.998,组间和组内变异系数均小于1%。应用该方法检测BMPs基因在半番鸭组织中的表达水平,结果显示,BMP1、 BMP2、 BMP5和BMP7基因在心脏中表达量较高,分别为5.5×10^(4)、 1.1×10^(5)、 5.1×10^(5)和7.7×10^(5)拷贝·μL^(-1);BMP6和BMP10基因在肝脏中表达量较高,分别为7.5×10^(4)和7.6×10^(3)拷贝·μL^(-1);而BMP3、 BMP4、BMP8a和BMP15分别在法氏囊、胸腺、喙和脾脏中表达量最高,分别为1.5×10^(5)、2.1×10^(4)、1.8×10^(3)和3.3×10^(3)拷贝·μL^(-1)。【结论】本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为检测鸭BMPs表达水平提供了技术手段。

摘要：【目的】建立一种可同时检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的PCR方法。【方法】根据已发布的鸭圆环病毒和鹅圆环病毒基因组分子特征设计3条引物,应用3条引物建立了一种在一个反应管中可检测并鉴别鸭圆环病毒和鹅圆环病毒的三引物PCR方法。【结果】该方法可特异性扩增鸭圆环病毒和鹅圆环病毒,并根据扩增片段大小鉴别病毒种类,检测最低限分别为110、80 pg·μL^(-1)。应用该方法对临床疑似病例样品进行检测,其结果与用2种病毒对应的单病毒PCR检测方法一致。【结论】建立的三引物PCR方法特异性强,敏感性高,丰富了水禽圆环病毒病的临床病例的诊断及流行病学监测的技术手段。

摘要：【目的】研究新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)弱毒S株C30在雏番鸭血液中的病毒血症,口咽、泄殖腔的排毒规律及靶器官的带毒时间,了解弱毒S株在雏番鸭体内的增殖规律和致弱机理。【方法】设计特异性引物,建立检测NDRV核酸的RT-qPCR方法;新型鸭呼肠孤病毒弱毒S株第30代(NDRV-S-C30)腿部肌肉注射2日龄雏番鸭,在免疫后1、2、3、4、6、8、10、12、14 d(Days post vaccination,dpv)采集其血液、肝脏、脾脏、泄殖腔分泌液和口咽液,用RT-qPCR方法检测NDRV在血液、口咽、泄殖腔及靶器官的增殖能力及带毒时间。【结果】建立了检测NDRV核酸的特异性RT-qPCR方法,使用该方法检测NDRV弱毒攻毒雏鸭的口咽和泄殖腔排毒时间分别为2~8 d和2~10 d,排毒高峰期为4~6 d;病毒血症时间为1~4 d,其中1~2 d为病毒血症高峰期;弱毒在肝脏的带毒时间为3~6 d,在脾脏的带毒时间为1~8 d。【结论】NDRV-S-C30弱毒株免疫雏番鸭后可通过口腔和泄殖腔向外界排毒,仅能引起较弱的病毒血症反应,且在肝脏中的增殖能力弱,丧失了对易感靶器官造成病理损伤的能力。明确了NDRV弱毒S株的排毒规律及病毒血症时间,为建立弱毒免疫效力评价方法奠定了基础。

摘要：[目的]获得羊口疮病毒(ORFV)115基因表达蛋白。[方法]利用Oligo 7软件设计并筛选出115基因特异性扩增引物,以ORFV FJ-ND株基因组为模板,通过PCR技术扩增获得其基因序列,再将115基因克隆至pGEX-6p-1上,重组质粒pGEX-6p-115,并对其进行测序鉴定,鉴定正确后转化RosettaganmiB(DE3)感受态细胞,通过优化IPTG浓度和诱导时间获得重组融合蛋白最佳表达条件,用SDS-PAGE对表达的目的蛋白进行分析。[结果]115基因全长450 bp,编码149个氨基酸;115基因可以在RosettaganmiB中表达,重组蛋白分子大小约42 kDa,主要以包涵体形式表达。[结论]成功克隆了ORFV 115基因,构建了pGEX-6P-115原核表达质粒,优化了重组蛋白表达条件并进行纯化,为进一步探索ORFV 115蛋白在感染宿主过程中的机制和作用奠定基础。