摘要：疫苗是预防和治疗疾病的重要手段 ,然而目前使用的多种疫苗均需反复接种 ,由于资金短缺、医疗条件差致使许多儿童辍种。所以必须研制单剂疫苗以取消加强免疫 ,降低成本 ,提高疫苗覆盖率。控释微球是疫苗投递的良好载体 ,通过专门设计的微球可以使其包裹抗原在不同的时间以脉冲方式释放以模仿加强免疫 ,从而实现通过一次接种即可使人体获得长期的免疫保护。

摘要：目的 制备重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB)复乳剂,研究其物理性质及免疫效率。方法 设计处方采用二步法制备复乳,显微镜观察乳滴结构及粒径分布,以电导法测定包封率,以经典法、离心法及电导法观察复乳的稳定性,免疫印迹观察抗原制备成复乳剂后免疫反应性的变化,以动物实验观察rUreB复乳的免疫效率。结果 制备的rUreB复乳性质稳定、包封率98.3％、粒径大小主要在2～10μm,免疫印迹及小鼠口服免疫后特异性抗体测定结果表明,该复乳具有良好的免疫原性,剂量小、免疫效率高。结论 将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位制备成复乳剂可得到高效、廉价、使用方便的疫苗,复乳是一个很有潜力的黏膜疫苗传送系统。

摘要：目的构建表达GST-STX2A1融合蛋白并鉴定其免疫原性。方法通过PCR反应从EHEC O157∶H7EDL933标准株菌中扩增STX2A1基因,将此基因克隆到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6p-1,得到阳性克隆PGEX-6p-1/STX2A1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导GST-STX2A1融合蛋白的表达,采用亲和层析纯化该蛋白,SDS-PAGE分析其表达量、表达形式和纯度;用纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,免疫双向扩散鉴定抗血清效价,Western blotting鉴定抗血清的特异性。结果成功构建重组质粒PGEX-6p-1/STX2A1,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致,并在大肠杆菌中表达出Mr约为5.3×104大小的可溶性目的蛋白,经亲和层析纯化后纯度可达90%,免疫Balb/c小鼠产生的抗血清效价为1∶16,Western blotting表明可与天然STX2A蛋白反应。结论在大肠杆菌中成功表达了可溶性的GST-STX2A1融合蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,为O157∶H7亚单位疫苗及制备抗STX2A1的单克隆抗体提供了必要的物质基础。

摘要：目的　构建表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 57∶H7志贺毒素Ⅱ结合亚单位 (Stx2B)与紧密黏附素C 端免疫保护性片段 (IntiminC30 0 )的融合蛋白 (Stx2B IntiminC30 0 ) ,并观察其免疫保护作用。方法　设计引物采用PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增Stx2B的编码基因stx2b ,T A克隆后在前期已构建原核表达质粒 pET 2 8a( + ) eaeC30 0的基础上构建融合基因表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测 ;通过包涵体洗涤与阴离子柱层析纯化 ,获得目的蛋白Stx2B IntiminC30 0 ,以Al(OH ) 3为佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠 ,再以EHECO1 57∶H7超声破菌液腹腔注射免疫后的小鼠 ,观察攻毒保护效果。结果　PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增出了约 2 90bp的目的片段 ;原核表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5% ;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 4 3× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。纯化后目的蛋白Stx2B IntiminC30 0的纯度达 75% ,免疫BALB/c小鼠后血清特异性抗体阳转率及抗体效价均显著增高 ,能够抵御致死剂量EHECO1 57∶H7超声破菌?

摘要：目的构建表达免疫活性的尿素酶功能片段原核表达体系。方法根据尿素酶B基因序列以及文献报道的尿素酶活性中心区域,primer5.0设计相应的引物,以Hp基因组为模版,PCR扩增拟表达的尿素酶活性片段,经测序证实后将片段亚克隆于原核表达载体pET28中,转入宿主菌BL21后IPTG诱导表达后,Tris-Tricine PAGE电泳及抗Hp特异性抗体western-tbollting鉴定目的蛋白表达。结果PCR从Hp基因组中扩增出414bp目的片段,经酶切及测序证实构建了功能片段表达阳性重组子,命名为pU414,IPTG诱导后电泳分析可以发现相应分子量附近出现可疑目的蛋白,能够被特异性血清识别。结论成功建立尿素酶活性功能片段蛋白表达载体,为下一步实验研究奠定基础。

摘要：目的　克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法　设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测。结果　PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增出了约 2 80 0bp和 90 0bp的目的片段 ;原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5 %和 30 %;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 96× 1 0 3和 35× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达。结论　EHECO1 5 7∶H7紧密黏附素免疫保护性片段经基因克隆后获得了较高的表达量 ,为进一步的生物学性质及免疫学特性研究奠定了基础。

摘要：目的构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株[BP(△BPSL1549)],建立有效的类鼻疽菌毒力基因敲除平台。方法设计引物扩增类鼻疽菌BPSL1549基因上下游同源臂,连接至p K18mob Sac B自杀质粒上,通过大肠杆菌S17-1λpir以接合方式将其转入类鼻疽菌中。利用同源重组原理替换野生株中的BPSL1549基因,经过蔗糖筛选靶标基因敲除株,并采用PCR、Western blot检测方法鉴定敲除株,利用动物模型评价敲除株表型变化。结果 BP(△BPSL1549)菌株与野生株的BPSL1549基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少600 bp,Western blot检测敲除株不表达BPSL1549基因编码蛋白,成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株。动物实验证实敲除株相比野生株毒力显著降低(P<0.05)。结论利用同源重组原理成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株,完善了类鼻疽菌敲除平台和评价体系。

摘要：目的针对中国汉族高频HLA-DRB1基因型人群,预测与鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,***)黏附素蛋白A亚单位(neuraminyllactose-binding hemagglutinin,HpaA)CD4+T细胞表位。方法通过Allele Frequency Net数据库分析中国汉族人群HLA-DRB1高频基因型,利用NetMHCIIpan对HpaA蛋白中能被这些高频基因型递呈的CD4+T细胞表位进行预测;通过PCR-SBT法筛选携带有这些高频基因型的***感染者,利用重组HpaA抗原刺激感染者外周血单个核细胞体外扩增出HpaA抗原特异性T淋巴细胞后利用合成短肽对所预测表位进行鉴定,通过抗体阻断实验对表位的HLA限制性进行分析,利用DC细胞负载重组HpaA蛋白对表位的自然递呈特征进行分析。结果中国汉族人群中HLA-DRB1高频基因型为DRB1*0901(14.4%)、DRB1*1202(13.3%)和DRB1*1501(10.8%),针对上述3种高频基因型预测出24个HpaA蛋白CD4+T细胞表位。其中,4个表位:HpaA39-53(HLA-DRB1*0901)、HpaA42-56(HLA-DRB1*0901)、HpaA89-103(HLA-DRB1*1202)和HpaA87-101(HLA-DRB1*1501)可有效刺激体外扩增的HpaA特异性T细胞产生高水平IFN-γ,且均能被DC细胞自然递呈。结论鉴定得到的4个HLA-DRB1限制性CD4+T细胞表位有可能成为***表位疫苗设计的候选抗原。

摘要：目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11 c(+)-stx2 a,经测序鉴定后转化***21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE和W esten b lot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2 a基因约950bp;原核表达质粒pET-11 c(+)-stx2 a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在***21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%。结论EHEC O157∶H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157∶H7菌的感染机制奠定基础。

摘要：目的表达纯化肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的紧密黏附素（intimin）及突变体intiminN916Y，并构建其转位紧密黏附素受体（translocatedint intin receptor，Tir）结合片段（intiminbinding domain，Tir-IBD），通过BIACore技术检测紧密黏附素及突变体intiminN916Y与***蛋白质相互作用特性的变化，探索特定氨基酸的突变对其黏附结合功能的影响。方法设计引物采用PCR法自EHEC0157：H7基因组扩增Tir—IBD的编码基因tir-~d，TA克隆后构建原核表达质粒pET-21a（＋）-tir—ibd，经测序鉴定后转化最coliBL21（DE3），IPTG诱导表达，PAGE检测。目的蛋白经***亲和纯化后，再用阴离子交换柱ResourceQ和分子筛柱Superdex200进行纯化。同时按包涵体复性后纯化的方案制备紧密黏附素及突变体intiminNgl6Y，将所得高纯度目的蛋白Tir-IBD适当稀释后耦联BIACore3000配套的NTA芯片，在25℃和37℃条件下分别以紧密黏附素及突变体***916Y作为流动相进行BIACore检测。结果EHEC0157：H7基因组扩增出了约270bp的目的片段；原核表达质粒pET-21a（＋）-tir-ibd经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化EcoliBL21（DE3）后IPTG诱导目的蛋白表达率约15％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（肘，）约10x103，破菌后电泳证实目的蛋白为可溶表达。Ni-NTA亲和纯化和阴离子交换纯化效果明显，高纯度的Tir-IBD蛋白耦联NTA芯片，在25℃和37℃条件下对紧密黏附素及突变体intiminN916Y与＇***相互作用的BIACore检测结果显示，intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性。结论EHEC0157：H7的紧密黏附素、突变体intiminN916Y及Tir-IBD经基因克隆后获得了较好的表达，纯化后获得高纯度的目的蛋白。在此基础上建立了蛋白相互作用的BIACore检测体系，证明intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性。