摘要：目的 探索将外源性ＩＬ－３ｃＤＮＡ导入骨髓基质细胞的可能性。方法 将小鼠ＩＬ－３ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体（ｐＬＸ－ＳＮ）上，然后将重组的ＩＬ－３ ｃＤＮＡ用脂质体转染到包装细胞ＰＡ３１７上，Ｇ４１８筛选后得到抗性克隆，将含病毒的上清液转染骨髓基质细胞。用自行设计的引物，检测ｐＬＸＳＮ上的ＮｅｏＲ基因及转入的ＩＬ－３基因。同时观察了转染ｐＬＸＳＮ／ＩＬ－３的基质细胞培养上清液对小鼠骨髓 ＣＦＵ－ＧＭ形成的影响，并测定其对造血因子依赖株 ＮＦＳ－６０细胞增殖活性的影响。结果 将含重组子 ｐＬＸＳＮ－ＩＬ－３和空载体ｐＬＸＳＮ的病毒培养上清感染 ＢＭＳ，前者用 ＰＣＲ扩增出５００ ｂｐ和１７０ ｂｐ（ＮｅｏＲ）的条带，后者仅扩增出 １７０ ｂｐ。转染ｐＬＸＳＮ／ＩＬ－３的基质细胞上清液有促进小鼠骨髓ＣＦＵ－ＧＭ增殖的作用，与空载体组及未转染组比较，有非常显著性差异（Ｐ＜０．０１）。结论 外源性的ＩＬ－３基因及ｐＬＸＳＮ上的ＮｅｏＲ已整合到骨髓基质细胞基因组ＤＮＡ中，并促进造血细胞增殖。

摘要：背景:严重烫伤导致机体免疫系统各方面的功能紊乱,活化的巨噬细胞可分泌许多生物活性递质。烧伤后巨噬细胞功能紊乱与信号转导的关系目前尚不清楚。目的:观察严重烫伤后不同时相点及运用特异性NF-κB抑制剂吡咯啉烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)后小鼠腹腔巨噬细胞内NF-κB活性、IκB-α的表达及肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化,从信号转导的角度探讨巨噬细胞功能紊乱的机制。设计:随机对照的实验研究。单位:创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室。材料:实验于1999-01/06在第三军医大学烧伤研究所实验室(国家级)完成。实验动物为健康清洁级近交系昆明小白鼠30只。干预:以小鼠常规烫伤模型造成体表面积15%Ⅲ度烫伤。实验按烫伤前及伤后不同时相随机分为6组,即0(正常对照组),2,6,12,24,48h组。收集腹腔巨噬细胞。采用放射免疫法检测TNF-α的含量,电泳迁移率改变分析法测NF-κB的活性,免疫印迹法测IκB-α的表达,反转录-PCR测TNF-αmRNA的表达。主要观察指标:①检测TNF-α的含量。②测定NF-κB的活性。③检测IκB-α的表达。④测TNF-αmRNA的表达。结果:烫伤后巨噬细胞分泌TNF-α亢进,于伤后12h达到高峰,为(1085.65±122.99)ng/L,较正常对照组明显增高(t=14.92,P<0.01)。NF-κB活性于伤后明?

摘要：背景:严重烫伤导致机体免疫系统各方面的功能紊乱,活化的巨噬细胞可分泌许多生物活性递质。烧伤后巨噬细胞功能紊乱与信号转导的关系目前尚不清楚。目的:观察烧伤后不同时相点肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的变化及运用特异性调控剂H-7后小鼠腹腔巨噬细胞内核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)活性及膜浆蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)的变化,在信号转导的水平探讨PKC是否参与了巨噬细胞TNF-α的调控,阐明巨噬细胞功能紊乱的某些机制。设计:以实验动物为研究对象的随机对照的实验研究。单位:一所军医大学的烧伤研究所。材料:实验于1999-01/12在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室(国家级)完成。实验动物为健康清洁级近交系昆明小白鼠,32只。方法:以本所小鼠常规烫伤模型造成体表面积15%Ⅲ度烫伤。实验按烫伤前及伤后不同时相随机分为6组,即0(正常对照组),2,6,12,24,48h6组。收集腹腔巨噬细胞。采用放射免疫法检测TNF-α的含量,电泳迁移率改变分析法测NF-κB的活性,同位素掺入测膜浆PKC活性。主要观察指标:①检测TNF-α的含量。②测定NF-κB的活性。③检测膜浆PKC的活性。结果:烫伤后巨噬细胞分泌TNF-α亢进,于伤后12h达到高峰,为(1085.65±122.99)ng/L,较正常对照组明显增高(t=14.

摘要：目的观察谷氨酰胺如何通过促进骨骼肌MG53二聚化,从而对严重烧伤小鼠骨骼肌膜修复产生影响,并探讨其作用机制。方法(1)动物实验。按随机数字表法(分组方法下同)将179只6~8周龄BALB/c雄性小鼠分为假伤组(43只)、烧伤组(73只)、烧伤+谷氨酰胺组(63只)。将假伤组小鼠背部致假伤,将烧伤组和烧伤+谷氨酰胺组小鼠背部造成Ⅲ度30%体表总面积烫伤(以下称烧伤)。烧伤+谷氨酰胺组小鼠灌胃谷氨酰胺1mg/kg,另2组小鼠灌胃等量氨基酸溶液,每天1次,持续14d。伤后12h,取10只烧伤组小鼠制备烧伤血清,用于后续细胞实验。假伤组在伤后即刻取10只小鼠,烧伤组和烧伤+谷氨酰胺组分别在伤后5、10、14d各取10只小鼠,心脏采血制备血清,然后处死取整块腓肠肌。伤后10d,3组分别另取6只小鼠处死后取整块趾短屈肌。伤后5、10、14d,3组分别另取9只小鼠处死后取整块腓肠肌。称取整块小鼠腓肠肌质量,考马斯亮蓝法检测小鼠腓肠肌总蛋白含量;双光子激光肌膜打孔检测小鼠趾短屈肌肌膜修复功能;放射免疫分析检测小鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)含量;采用非还原性电泳-蛋白质印迹法检测小鼠腓肠肌中MG53二聚体及单体表达,蛋白质印迹法检测小鼠腓肠肌中内质网应激标志蛋白CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白表达。(2)细胞实验。体外培养小鼠骨骼肌前体细胞C2C12,选第2代细胞进行实验。将细胞分为正常对照组、烧伤血清组、烧伤血清+谷氨酰胺组,每组3皿,每皿1×10^3个细胞,正常对照组细胞加入1mL含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液,烧伤血清组细胞加入1mL含有体积分数10%烧伤血清的DMEM培养液,烧伤血清+谷氨酰胺组细胞加入1mL含有体积分数10%烧伤血清及4μL终物质的量浓度为8mmol/L的谷氨酰胺的DMEM培养液。培养24h后,同前检测小鼠骨骼肌前体细胞分化后肌细胞膜修复功能。另取细胞同前分组及培养,每组3孔,每孔1×10^5个细胞,培养24h后同前检测细胞中MG53二聚体及单体表达及细胞中内质网应激标志蛋白表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、SNK检验。结果动物实验。(1)与假伤组比较,烧伤组伤后5、10、14d小鼠腓肠肌质量和总蛋白含量均明显降低(P0.05)。与正常对照组(58.5±1.8)比较,烧伤血清组培养24h细胞MG53二聚体表达明显降低(14.1±1.4,P<0.05),与烧伤血清组比较,烧伤血清+谷氨酰胺组培养24h细胞MG53二聚体表达明显升高(30

摘要：目的观察非诺贝特对严重烧伤大鼠肝脏脂肪变性的疗效。方法将27只雄性sD大鼠按照随机数字表法分为假伤组、单纯烧伤组、烧伤＋非诺贝特组，每组9只。假伤组大鼠将背部浸入37℃温水中15s模拟致伤，之后不予处理。其余2组大鼠将背部浸入98℃热水中15s造成30％TBSAm度烫伤（以下称烧伤），伤后1h腹腔注射乳酸钠林格液。伤后24h起，烧伤＋非诺贝特组大鼠给予生理盐水稀释的非诺贝特（药物剂量为80mg·kg-1·d-1），连续给药7d，单纯烧伤组大鼠则给予等体积生理盐水。（1）于伤后4、6、8d，各组分别选取3只大鼠采集下腔静脉血，采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）含量；取血后称取大鼠体质量，随即处死大鼠取肝脏称取湿质量，计算后者与前者比值即肝脏指数，同时行肝脏组织大体观察。（2）各时相点下每只大鼠留取1块肝脏组织样本，HE染色观察组织病理学变化；各时相点下每只大鼠选取1张HE染色切片，评估肝脏脂肪变性程度，并统计各组各级肝脏脂肪变性鼠数。对计量资料行析因设计方差分析及SNK检验，对计数资料行Kruskal-Wallis检验和Nemenyi检验。结果（1）伤后4d，单纯烧伤组大鼠TC、TG、FFA、HDL含量与假伤组比较，差异明显（P值均小于0．05）；烧伤＋非诺贝特组大鼠TC、TG、FFA含量均明显低于单纯烧伤组（P值均小于0．05），HDL含量与单纯烧伤组相近（P〉0．05）；3组大鼠LDL含量相近（P值均大于0．05）。伤后6d，单纯烧伤组大鼠TC、TG、HDL含量与假伤组比较，差异明显（P每均小于0．05）；烧伤＋非诺贝特组大鼠TC、TG含量均明显低于单纯烧伤组（P值均小于0．05），HDL含量明显高于单纯烧伤组（P〈0．05）；3组大鼠FFA、LDL含量相近（P值均大于0．05）。伤后8d，单纯烧伤组大鼠TC、HDL含量与假伤组比较，差异明显（P值均小于0．05）；烧伤＋非诺见特组大鼠TC含量明显低于单纯烧伤组（P〈0．05），HDL含量与单纯烧伤组相近（P〉0．05）。3组大鼠TG、FFA和LDL含量相近（P值均大于0．05）。（2）假伤组大鼠伤后各时相点肝脏组织大体情况与烧伤＋非诺贝特组相似，质地柔嫩，切面无油脂沾染。单纯烧伤组大鼠伤后各时相点肝脏组织表面散在暗黄色斑块，切面有油脂沾染，以伤后6d最为明显。伤后4d，假伤组、单纯烧伤组、烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏指数相近（F=1．63，P〉0．05）。伤后6、8d，假伤组、单纯烧伤组、烧伤＋非诺见特组大鼠肝脏指数分别为0．0416±0．0016、0．0533±0．0054、0．0370±0．0069及0．0423±0．0034、0．0624±0．0005、0．0444±0．0042，其中单纯烧伤组大鼠肝脏指数明显高于其余2组（P值均小于0．05），假伤组、烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏指数相近（P值均大于0．05）。（3）假伤组大鼠伤后各时相点肝脏组织结构正常；单纯烧伤组大鼠伤后各时相点存在弥散小泡性肝细胞脂肪变性，以伤后6d最为明显；烧伤＋非诺贝特组大鼠伤后4d肝脏有轻度脂肪变性，伤后6d起肝脏组织结构逐渐恢复正常。假伤组大鼠肝脏脂肪变性程度均为0级；单纯烧伤组大鼠肝脏脂肪变性程度为Ⅰ级1只、Ⅱ级1只、Ⅲ级7只；烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏脂肪变性程度为0级3只、Ⅰ级4只、Ⅱ级2只。单纯烧伤组大鼠肝脏脂肪变性程度重于其余2组（x2值分别为56．25、162．44，P值均小于0．05），烧伤＋非诺贝特组大鼠肝脏脂肪变性程度重于假伤组（x2=27．51，P〈0．05）。结论非诺贝特能纠正严重烧伤大鼠血脂代谢异常，在一定程度上减轻肝脏脂肪变性程度。

摘要：目的观察雌激素在小鼠表皮发育和Kc（人表皮细胞株HaCaT）增殖中的作用并探讨其机制。方法（1）通过阴道脱落细胞检查法选取5只处于动情期成年C57BL／6小鼠设为动情期组，另将性发育前行卵巢切除的5只成年C57BL／6小鼠设为卵巢切除组。取2组小鼠尾根部全层皮肤，HE染色观测表皮厚度，免疫组织化学染色观察表皮中增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞分布并计数。（2）取对数生长期HaCaT细胞，用含体积分数10％FBS的RPMI1640培养液培养，按随机数字表法分为阴性对照组、单纯雌二醇组、蛋白激酶B（Akt）抑制剂组、细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂组，每组20孔。各组培养液中，阴性对照组加入1nL二甲基亚砜；单纯雌二醇组加入100nmol／L17 β-雌二醇1 μL；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组均加入同前剂量与体积17 β-雌二醇，另分别加入10 μmol／L LY294002和30 μmol／LPD98059各1 μL。分别于培养0（即刻）、24、48、72h，每组取5孔细胞，用细胞计数试制盒8与酶标仪检测细胞增殖活性。（3）取对数生长期HaCaT细胞，同前分组处理，每组3孔。培养72h，用流式细胞仪检测细胞周期分布，计算细胞增殖指数（PI）。（4）取对数生长期HaCaT细胞，同前分组处理，每组3皿。培养72h，蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化ERK（p-ERK）和PCNA蛋白水平。细胞实验均重复3次。对数据行t检验、单因素方差分析、析因设计方差分析、LSD检验。结果（1）卵巢切除组小鼠表皮厚度为（33．5±3．0） μm，明显薄于动情期组的（51．4±3．1） μm（t=20．7，P〈0．01）。2组小鼠PCNA阳性细胞主要集中于表皮基底层；卵巢切除组小鼠表皮中PCNA阳性细胞数为每200倍视野下（37±12）个，明显少于动情期组的每200倍视野下（96±15）个（t：15．3，P〈0．01）。（2）培养0～48h，单纯雌二醇组与阴性对照组细胞增殖活性差异不明显（P值均大于0．05）。培养72h，与阴性对照组比较，单纯雌二醇组细胞增殖活性明显增高（P〈0．01）；Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞增殖活性均明显低于前2组（P值均小于0．01）。（3）与阴性对照组的（51．6±1．1）％比较，单纯雌二醇组细胞PI明显升高[（58．5±0．8）％，P〈0．05]；Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞P1分别为（34．9±0．8）％、（48．2±0．4）％，均明显低于前2组（P值均小于0．01）。（4）与阴性对照组的0．566±0．034比较，单纯雌二醇组细胞p-Akt蛋白水平明显升高（1．048±0．077，P〈0．01）；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞p-Akt蛋白水平分别为0．682±0．095、0．672±0．019，明显低于单纯雌二醇组（P值均小于0．01）。与阴性对照组的0．469±0．013比较，单纯雌二醇组、Akt抑制剂组、ERK抑制刊组细胞p-ERK蛋白水平均明显升高（1．064±0．089、1．010±0．038、0．778±0．065，P值均小于0．01）。与单纯雌二醇组比较，ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平明显降低（P〈0．01）。与阴性对照组的0．386±0．053比较，单纯雌二醇组细胞的PCNA蛋白水平明显升高（0．743±0．043，P〈0．01）；Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞PCNA蛋白水平分别为0．264±0．019、0．223±0．065，明显低于前2组（P值均小于0．01）。结论雌激素缺乏时，小鼠表皮发育能力减弱。雌激素（17β-雌二醇）可通过激活ERK／Akt信号通路上调PCNA表达，以促进HaCaT细胞的增殖。

摘要：目的介绍一种简易的豚鼠眨眼反应测量方法,并观察其在眨眼条件反射训练过程中的应用效果。方法采2 kHz的正弦波纯音和压强为3.0 psi的束状医用氧气流先后作用于豚鼠左侧眼角膜,训练豚鼠建立眨眼条件反射,在此过程中利用高分辨率、低扭矩的肌肉张力换能器测量眨眼活动。结果训练第14天豚鼠追踪性眨眼条件反射习得率为(87.0±12.9)%,显著高于训练第1天的习得率(8.0±6.3)% (P=0.003);训练第10天豚鼠延迟性眨眼条件反射习得率为(86.0±13.0)%,显著高于训练第1天的习得率(5.5±5.0)% (P=0.001)。在此过程中,测量了豚鼠习得条件眨眼反应的峰潜伏期、持续时间和幅度,所得结果与相关报道一致。结论本教研室设计的眨眼反应测量方法操作简单,结果准确,可用于研究小型啮齿类动物眨眼条件反射训练中眨眼活动的拓扑学参数变化。

摘要：目的 根据毕赤酵母密码子偏好,设计并改造人CTLA4胞外区cDNA,构建毕赤酵母分泌型表达载体,以实现人CTLA4胞外区蛋白在毕赤酵母中的高效表达。方法利用PCR定点突变技术,将人CTLA4胞外区cDNA中的毕赤酵母低频使用密码子突变成高频使用密码子而不改变其氨基酸序列;经DNA序列测定证实后插入毕赤酵母高拷贝表达载体pPIC9K a分泌信号下游,SacⅠ线性化后电转GS115;G418梯度筛选转化菌;PCR鉴定目的基因整合;甲醇诱导表达,SDS-PAGE、Western blotting、肽质量指纹等鉴定表达蛋白。结果成功地对人CTLA4胞外区cDNA进行了定点突变,该突变体在毕赤酵母中能成功表达CTLA4胞外区蛋白。结论 为高效表达人CTLA4胞外区蛋白及其功能研究和临床应用奠定了基础。

摘要：目的设计并制备有效干扰细胞内锌指蛋白A20（简称A20）表达的基因沉默载体，初步用于观察A20基因沉默对细胞炎症应答的影响。方法人工设计并合成A20特异性RNA干扰寡核苷酸片段（ASRF），构建A20基因沉默载体pSUPER～EGFP—A20 siRNA。采用基因转染技术使人单核细胞株THP1感染pSUPER—EGFP—A20 siRNA，用适时荧光定量PCR技术鉴定转染细胞A20基因的沉默率；用ELISA测定细胞核内NF—κB活性及培养上清液中的TNF—α水平。结果在设计的2条ASRF中，以M59465—385R／F对细胞A20表达的抑制效果最佳，基因沉默率达83．86％。初步应用表明，A20基因沉默后THP1内NF—κB活性水平增加了78．13％，释放的TNF—α增加了49．30％。结论成功得到了高效A20基因沉默载体，初步应用研究提示A20表达的意义在于下调细胞炎症应答程度。

摘要：背景:人羊膜为半透明的薄膜,含有多种促进细胞增殖的营养成分,是一种较好的负载角朊细胞的生物材料。目的:将人羊膜负载培养猪角朊细胞构建皮肤表皮替代物,并观察猪角朊细胞在人羊膜上生长增殖的形态特点。设计:以细胞为研究对象,单一样本研究,重复测量观察。单位:解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所。材料:实验于2001-01/11在创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室,第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所完成。猪角朊细胞取自3月龄贵州小香猪。方法:将贵州小香猪的角朊细胞原代培养,传代扩增后,将角朊细胞以1.63×105/cm2的密度接种于人羊膜基质面,逐日于倒置显微镜下观察角朊细胞的生长增殖变化情况,并于培养3d与15d进行光镜、电镜观察,检测角朊细胞在人羊膜上的生长情况。主要观察指标:角朊细胞在人羊膜上的生长情况。结果:倒置显微镜下观察接种后30min内明显见到角朊细胞在人羊膜上黏附,24h内大部分黏附生长,3d形成单层完全覆盖人羊膜。光镜下人羊膜负载角朊细胞3d,可见角朊细胞在人羊膜基质面黏附呈单层生长,细胞扁平紧密排列。扫描电镜下可见胞体呈多边形,多见胞膜突起。透射电镜下可见角朊细胞与人羊膜黏附良好,生长在人羊膜上的角朊细胞内有许多角质丝。生长至15d,在倒置显微镜和扫描电镜下均可见,细胞因过于拥挤而隆起,因老化而形成较多碎片,部分细胞有空洞形成。结论:人羊膜是角朊细胞在体外培养的良好载体,对角朊细胞有明显的促增殖作用。但人羊膜负载角朊细胞生长至15d,因老化部分细胞有空洞形成。