摘要：目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A（PE），为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因，将其克隆于原核表达载体pQE-31中，所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109，IPTG诱导表达；制备融合蛋白包涵体，并采用Ni—NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白；采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性，MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化，扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致；转化*** JM109后，IFTG诱导目的蛋白表达率约为25％；SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（Mr）约为66×10^3，与理论预期值一致；破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95％。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度（IC50值）分别为2．13μg/ml、2．58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化，获得了具有细胞毒活性的重组PE，为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。

摘要：目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达、纯化,为进一步利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础。方法运用Bioedit和DNAStar软件对MRSA耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段序列和活性区结构特点及其活性发挥进行分析,设计TG-TPase嵌合药靶,并通过引物设计从MRSA菌株中克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP基因片段,进一步用引物延伸法、酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因并亚克隆至原核表达质粒pET30b中,转化Rosetta(DE3)plysS大肠埃希菌,用IPTG进行诱导表达,并小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化和Western blotting鉴定。结果设计的TG-TPase嵌合药靶包括PBP2分子的TGase活性区、绞链区的N-端,PBP2a分子绞链区C-端及完整的TPase结构域,融合基因为1 935 bp,编码645个氨基酸,等电点为7.10,相对分子质量72 000。用PCR法从MRSA菌株中成功克隆了青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达出药靶蛋白,表达结果与预期设计相符合。融合蛋白纯化分析表明,融合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上。结论成功设计、构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,并对融合蛋白进行了初步纯化,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。

摘要：目的设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,构建其真核表达质粒,为嵌合基因的高效、分泌型表达奠定基础。方法在序列结构分析的基础上,设计引物从MRSA菌株中扩增其耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段,进一步用酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因,亚克隆至酵母表达质粒pPIC9K中,转化DH5α大肠埃希菌。经酶切、PCR和核苷酸测序鉴定正确的重组质粒用SalⅠ线性化,整合入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,在DNA和基因转录水平鉴定出阳性重组酵母。结果采用PCR从MRSA基因组中扩增得到了873bp的TGase片段和1044bp的TPase片段。以酶切连接构建的TG-TPase嵌合基因经酶切、PCR鉴定,能获得约1900bp的融合片段,与预期结果相符,测序表明序列和阅读框均正确。线性化的重组质粒转化GS115后,得到5个高拷贝阳性转化子,经诱导表达和PCR鉴定,这些转化子能转录出目的基因的mRNA。结论成功构建了含TG-TPase嵌合基因的重组毕赤酵母工程菌,为进一步高效制备嵌合蛋白、进而利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选创造前提。

摘要：以ＡｎｇｒａｙＳＫ和自行设计的引物作半套式ＰＣＲ，成功地从人外周血Ｂ淋巴细胞中扩增出Ｉｇ重链可变区基因。扩增产物的分子量为６６０ｂｐ左右。该文结果提示，在建立全套抗体基因文库时，半套式ＰＣＲ法能较好解决Ｉｇ可变区基因多样性的扩增问题。

摘要：目的:克隆表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因并检测其活性.方法:应用PCR技术从铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因,将其克隆于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;采用Ni-NTA柱亲和层析分离纯化目的蛋白;提取铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖,观察目的蛋白对胞外多糖的降解活性.结果:采用PCR技术成功扩增了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因,所构建的重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化***109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为20.4×103,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要在上清中以可溶形式表达.经Ni-NTA柱亲和层析后蛋白纯度大于95%.初步活性检测结果表明重组PaP3多糖解聚酶蛋白对生物膜胞外多糖具有一定的降解作用.结论:重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌的胞外多糖,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.

摘要：体外不表达而只在体内才表达的基因称为体内诱导基因。研究表明,体内诱导基因涉及病原菌在体内的生存和致病过程,因此有重要意义。最近提出的体内诱生抗原鉴定技术(invivo-inducedantigentechnology,IVIAT)就是用于筛选病原菌体内诱导基因的一种方法。该方法不使用动物模型,而是采用经病原菌体外表达抗原吸收处理的病人血清来检测病原菌的表达文库,从而筛选体内诱导基因;方法简便、快速。这些筛选得到的体内诱导基因有助于病原菌致病机制的研究,同时也能够为抗菌药物、诊断试剂及疫苗设计等研究提供潜在靶标。

摘要：创新性自学能力是大学生在未来社会生存与发展中不可缺少的能力,培养本科生创新性自学能力的关键是教学方法的改革。在微生物学教学中开展学导式教学法;自学讨论式教学法在细菌学各论教学中的应用;进行专题讲座,提出问题,收获于问题;突出设计性实验,培养学生对科学研究的兴趣、科研创新意识;加强科研训练,培养创新能力等综合措施。

摘要：肺炎链球菌是引起细菌性肺炎的主要病原菌。透彻地了解肺炎链球菌的信号转导对于系统地认识该菌的致病机制和靶标药物的设计具有重要意义。二元信号转导系统作为在病原菌中普遍存在的一种跨膜信号转导机制,在细菌响应外界环境变化并作出适应性反应的过程中起着主要作用。随着大规模基因组测序、信号标签诱变、差异荧光诱导以及DNA微阵列等技术的蓬勃发展,关于肺炎链球菌的二元信号转导系统已经取得了许多重要的研究成果。本文就肺炎链球菌二元信号转导系统的研究进展作一综述。