摘要：目的研究手术创伤对Toll样受体4(TLR4)/髓样分化蛋白2(MD2)表达的影响及其临床意义。方法设计自身配对实验,采集12例手术患者外周静脉血;用密度梯度离心法和黏附洗脱法分离单核细胞,用流式细胞仪检测单核细胞TLR4和MD2的表达;血浆脂多糖(LPS)、血浆TNFα和IL10,以及血浆TLR4和MD2含量分别用鲎试剂法、放免法和ELISA法检测。结果单核细胞TLR4和MD2在术后第1～3天显著上调表达(P0.05);血浆IL10于术后第3天显著升高(P0.05)。结论手术创伤早期可导致TLR4/MD2上调表达,致机体敏感性增强;此后血浆抑制性介质IL10和MD2升高并产生免疫抑制效应。这种双向性变化可能是大手术后全身炎症反应综合征(SIRS)和脓毒症发生的分子机制之一。

摘要：目的　设计合成靶向核因子 -κB(NF -κB)的哑铃形圈套寡核苷酸 (ODNs) ,并检测其抗炎效应。　方法　提取大鼠腹腔巨噬细胞 (pMΦ) ,随机分为正常对照组、单纯内毒素 (LPS)组、圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。收集正常对照组和单纯LPS组LPS刺激后 1,2 ,6 ,12 ,18,2 4h上清及细胞 ;采用阳离子脂质体按质量比为 4∶1的比例分别介导 2 ,4,8mg L圈套ODNs转染大鼠pMΦ细胞 ,6h后用LPS刺激 ,收集转染后 8,12 ,18h上清及细胞。细胞免疫组化法分析LPS刺激前后p6 5表达与分布变化 ,用酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测上清中肿瘤坏死因子 -α(TNF -α)、白细胞介素 - 6 (IL - 6 )蛋白表达 ,逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)法检测TNF -α、IL - 6和IL - 10mRNA转录。　结果　 4,8mg L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠pMΦTNF -α、IL - 6转录和表达。　结论　靶向NF -κB的哑铃形圈套ODNs具有拮抗炎症介质转录和表达的功能。

摘要：目的　设计合成靶向NF κB的哑铃形“圈套”ODNs ,并检测其对NF κB转录活性和肾小球系膜细胞IL 6表达的抑制效应。方法　采用电泳迁移率改变实验 (EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞 ,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将 2、4、8mg L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞 ,6h后用LPS刺激 ,收集转染后 8、12、18h上清和细胞。用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测上清IL 6蛋白表达 ,逆转录PCR(RT PCR)法检测IL 6mR NA转录。结果　哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF κB与其顺式元件的结合 ;4、8mg L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞IL 6转录和表达。结论　靶向NF κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF κB的转录活性 ,从而对体外培养的肾小球系膜细胞炎性因子IL

摘要：目的设计合成靶向NF-κB的哑铃形“圈套”ODNs,并检测其对NF-κB转录活性和肾小球系膜细胞细胞因子(TNF-α和IL-6)表达的抑制效应。方法采用电泳迁移率改变实验(EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF-κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将2、4和8mg/L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞,6h后用LPS刺激,收集转染后8、12和18上清和细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清细胞因子蛋白表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检测细胞因子mRNA转录。结果哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF-κB与其顺式元件的结合;4、8mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞TNF-α和IL-6转录与表达。结论靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF-κB的转录活性,从而对体外培养的肾小球系膜细胞细胞因子的表达具有抑制效应。

摘要：目的:利用生物信息学原理,设计针对髓样分化蛋白-2的与脂多糖结合的模拟小肽,为研制具有抗炎效应的髓样分化蛋白-2拮抗多肽奠定基础。方法:实验于2004-01/12在第三军医大学野战外科研究所第一研究室完成。采用Goldkey核酸和蛋白质分析软件及核酸和蛋白质数据光盘、PC/Gene软件系统;EMBL提供的PRS服务器、NCBI提供的BLAST服务器及Superfamily等互联网服务器,分析髓样分化蛋白-2的氨基酸序列,预测髓样分化蛋白-2的新功能,寻找髓样分化蛋白-2与脂多糖结合的关键位点。结果:①髓样分化蛋白-2的氨基酸序列功能位点信息:在96～141位氨基酸具有多达5个的功能位点。②髓样分化蛋白-2的Superfamily超家族预测:K128和K132是与脂多糖结合域的关键氨基酸,以K128-K132为中心的肽段呈现较强的亲水性,即NH2-FSKGKYKCV-COOH。结论:如果人工合成髓样分化蛋白-2与脂多糖结合域的关键序列,即“髓样分化蛋白-2模拟小肽”,并以此段多肽为靶,采用噬菌体随机肽库筛选,可望得到天然髓样分化蛋白-2的拮抗多肽。

摘要：目的检测NF-κB p65亚基结合肽与p65间相互作用的亲和常数,以及其对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。方法借助于生物传感器技术分析NF-κB p65亚基结合肽与p65相互作用的动力学,同时应用竞争性ELISA鉴定结合多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。结果生物传感器技术分析结果表明5条p65结合肽均能与p65发生相互作用,相互作用的亲和常数分别为GST-BPT1:2.67×10-7mol/L、GST-BPT2:9.02×10-6mol/L、GST-BPT3:1.07×10-6mol/L、GST-BPT4:8.03×10-6mol/L、GST-BPT5:9.83×10-7mol/L。竞争性ELISA检测结果表明5条p65结合肽均能在一定程度上抑制NF-κB与其顺式作用元件κB基序的结合,且这种抑制效应随多肽浓度的增加而增强。结论酵母双杂交筛选获得的5条p65结合多肽与p65间确实存在相互作用,且5条结合肽对NF-κB DNA结合活性均有一定的抑制效应,由此提示以这些多肽为先导物设计和开发靶向NF-κB的抗炎多肽药物将成为可能。

摘要：目的　构建一个含 16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库。方法　设计合成编码 16肽的随机DNA片段 ,PCR扩增随机DNA片段 ,经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH RP并检验其库容。结果　扩增获得编码 16肽的随机DNA片段 ,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,与GAL4AD形成融合蛋白 ,其库容为 1 2 8× 10 7。

摘要：目的构建干扰人SUMO-2表达的shRNA重组质粒载体,并筛选下调人SUMO-2表达的稳定细胞株。方法设计并合成针对人SUMO-2的shRNA寡核苷酸,并将其克隆至pLKO.1质粒载体上,转染HCT116细胞后经嘌呤霉素筛选获稳定表达细胞株,并通过免疫印迹鉴定SUMO-2的表达。结果成功构建干扰人SUMO-2表达的pLKO.1质粒载体,可在HCT116细胞中稳定表达,且能有效抑制SUMO-2蛋白质的表达。功能研究初步证明干扰SUMO-2表达可抑制细胞增殖并使处于细胞周期G1期的细胞比例上升。结论获得了干扰人SUMO-2表达的pLKO.1-shRNA质粒载体,以及下调SUMO-2表达的HCT116稳定细胞株。

摘要：目的应用片段缺失突变技术鉴定HDAC2自身磷酸化对其Sumo-E3连接酶活性及蛋白质翻译的影响。方法以前期获得的鼠源性HDAC2Sumo-E3连接酶结构域基因片段为模板,设计片段缺失突变引物,经长片段重叠延伸PCR技术扩增获得片段缺失突变基因片段,后于Top10大肠杆菌中自然连接扩增获得pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3连接酶磷酸化结构域缺失突变的真核表达载体。然后将载体转染于L929成纤维细胞瞬时过表达突变基因,再经翻译反应性荧光素酶报告基因实验和Western-blot鉴定HDAC2自身磷酸化修饰对Sumo-E3连接酶介导的报告基因和靶蛋白质表达的影响。最后通过MTT实验检测HDAC2自身磷酸化修饰对其Sumo-E3连接酶介导的L929细胞增殖的影响。结果成功构建获得磷酸化修饰完全缺失的HDAC2片段缺失突变体pcDNA3.1/HDAC2-Sumo-E3(DEL 394-424AA)。LUC报告基因检测结果显示,DEL 394-424AA片段缺失突变体促进LUC翻译是对照组的4.24倍,且能显著促进靶蛋白ODC和c-Myc的表达,以及L929小鼠成纤维细胞的增殖效应。结论 HDAC2自身磷酸化修饰对HDAC2Sumo-E3连接酶活性及其调节的蛋白质翻译和细胞增殖作用起负性调节作用。

摘要：目的　设计合成靶向 NF-κB的哑铃形圈套 ODNs,并检测其对 NF-κB转录活性和肾小球系膜细胞细胞因子 (IL - 6和 TGF-β1)表达的抑制效应。方法　采用电泳迁移率改变实验 (EMSA)体外检测哑铃形圈套 ODNs对 NF-κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞 ,随机分为正常对照组、L PS刺激组、哑铃形圈套 ODNs处理组、无关圈套 ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将 2、4、8mg/ L 不同剂量哑铃形圈套 ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞 ,6 h后用 L PS刺激 ,收集转染后 8、12、18上清和细胞。用酶联免疫吸附试验 (EL ISA)法检测上清细胞因子蛋白表达 ,逆转录 PCR(RT- PCR)法检测细胞因子 m RNA转录。结果　哑铃形圈套 ODNs在体外能有效地抑制 NF-κB与其顺式元件的结合 ;4、8mg/ L剂量哑铃形圈套 ODNs可明显抑制 L PS诱导的大鼠肾小球系膜细胞 IL - 6和 TGF-β1 转录与表达。结论　靶向 NF- κB的哑铃形圈套 ODNs在体外可抑制 NF- κB的转录活性 。