摘要：背景与目的:肺癌细胞的多药耐药(multi-drugresistance,MDR)是药物治疗失败的重要原因,但其机制尚未完全清楚。我们已经通过SSH发现了1条新的耐药相关基因片段,经检索GenBank,发现其与2001年4月公布的一条新的基因序列BC006151同源性高达99%。本研究旨在克隆该基因的全长,并检验该基因在几种肺癌细胞株中的表达,为进一步研究其功能和调控奠定基础。方法:根据BC006151基因序列设计引物,通过RT-PCR证实肺腺癌MDR细胞SPC-A-1/cDDP确实包含BC006151基因后,扩增该基因全长cDNA,通过测序对所得序列进行分析,并对其编码蛋白的氨基酸序列进行预测。应用半定量RT-PCR方法检验小细胞肺癌SH77、大细胞肺癌H460、肺腺癌SPC-A-1和SPC-A-1/cDDP等细胞株中该基因mRNA的表达。结果:成功克隆了BC006151基因的全长cDNA片段,长1298bp,它具有完整的阅读框和编码区,并与经SSH获得的片段有极高的同源性。该基因在MDR细胞株SPC-A-1/cDDP的表达明显高于其亲代细胞株;SPC-A-1表达高于H460,SH77未见表达。结论:BC006151基因是与cDDP致肺腺癌MDR密切相关的一条新基因。该基因全长cDNA片段的克隆将有助于阐明其在肺癌MDR发生中的作用。

摘要：目的:研究CD44v3在透明质酸诱导A549细胞体外粘附和侵袭中的作用。方法:设计和构建能产生针对CD44v3的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的RNA干扰质粒,转染A549细胞,以RT-PCR和Westernblot检测A549细胞转染前后CD44v3表达,以平板粘附模型和波登氏小室模型检测A549细胞转染前后粘附和侵袭能力。结果:和转染前相比,转染了RNA干扰质粒的A549细胞CD44v3mRNA和蛋白表达以及受透明质酸诱导而粘附于平板和穿过波登氏小室隔膜的细胞数皆明显减少(P<0.01)。结论:CD44v3介导了透明质酸诱导人肺腺癌A549细胞体外粘附和侵袭行为。

摘要：目的　合成人 β防御素 2 (Humanβ defensin 2 ,hBD 2 )基因并构建其真核表达载体 ,为hBD 2基因的转染和表达奠定基础。方法　根据GenBank中的hBD 2结构基因序列 ,设计合成了 3条长度为 82bp的长寡聚核苷酸引物 (H1、H2、H3 ) ,用PCR延伸扩增的方法进行全长为 2 11bp的基因合成 ;PCR产物经双酶切后 ,克隆入真核表达载体pLXSN并导入细菌扩增。结果　PCR产物和重组载体经凝胶电泳及测序分析 ,证实合成的基因与原序列一致 ,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上。结论　用PCR延伸扩增法合成基因 ,能方便快捷地获得目的基因片段 ,提高了基因合成的准确性 。

摘要：目的　探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na+ H+ 交换器 1表达和活性、pHi的影响 ,及其与细胞增殖的关系。方法　构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体 ,将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞 ,G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE 1mRNA表达、pHi、pHi恢复速率、2 2 Na摄取量和3H TdR掺入量变化。结果　与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较 ,转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE 1mRNA表达、2 2 Na摄取量减少 ,同时伴有pHi降低、pHi恢复速率下降和3H TdR掺入量减少。结论　所设计的锤头状核酶可对NHE 1mRNA进行特异性切割 ,减少其表达 ,使其活性下降 ,从而诱导细胞酸化 。

摘要：目的研究自组装核酸纳米材料携带的mTOR小干扰RNA(self-assembled nucleic acid nanoparticles loaded mTOR small interfering RNA,siRNA-NPs)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary arterial smooth muscle cells,RPASMCs)自噬和增殖的影响。方法设计并合成DNA序列m T-2A、m T-1A3以及5'端标记Cy3的mTOR siRNA,共设计mTOR siRNA序列3条,选其中最佳序列,将上述核酸材料按照操作步骤自组装合成三角板型的核酸纳米材料。实验分4组:核酸纳米材料携带的mTOR siRNA组(siRNA-NPs组)、单纯纳米材料组(NPs组)、单独的siRNA组和空白对照组。各组材料分别转染RPASMCs 24 h,激光共聚焦显微镜观察RPASMCs对核酸纳米材料携带的mTOR siRNA的摄取情况;应用RT-PCR检测各组细胞中mTOR mRNA的表达水平,应用Western blot检测p-mTOR、LC3B蛋白的表达水平;激光共聚焦、透射电镜检测细胞自噬水平;MTT及3H-TdR检测各种材料处理后对细胞的生长的影响。结果激光共聚焦显微镜下可见siRNA-NPs组细胞质内均匀分布大量呈颗粒状的红色荧光物质,其荧光强度均显著高于单独的siRNA组(P<0.05);而且siRNA-NPs组处理的mTOR mRNA和p-mTOR蛋白表达显著低于单独的siRNA组、NPs组及空白对照组(P<0.05);而LC3B蛋白表达显著高于其他各组(P<0.05),激光共聚焦检测显示siRNA-NPs组标记自噬小体的绿色荧光明显强于单独的siRNA组、NPs组及空白对照组(P<0.05),电镜结果显示siRNA-NPs能明显诱导细胞自噬小体形成;MTT及3H-TdR检测siRNA-NPs和单独siRNA处理RPASMCs后明显抑制其生长,且siRNA-NPs组细胞生长抑制率又显著高于单独的siRNA组(P<0.01)。结论 siRNA-NPs能被RPASMCs有效摄取并明显抑制靶基因的表达,进而诱导细胞自噬并且抑制其细胞增殖。

摘要：背景:慢性阻塞性肺疾病是以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征,这些炎症细胞数量增加和活性改变的机制目前还不十分清楚。目的:探讨慢性阻塞性肺疾病患者外周血中性粒细胞凋亡特点及其与慢性阻塞性肺疾病发生发展的关系,以期为慢性阻塞性肺疾病患者的早期干预和功能监测提供参考方向。设计:以慢性阻塞性肺疾病患者为观察对象,健康人群为对照组的观察对比研究。单位:一所军医大学医院的呼吸内科。对象:观察对象为2003-02/12因慢性阻塞性肺疾病急性发作在第三军医大学大坪医院野战外科研究所呼吸内科住院的慢性阻塞性肺疾病患者,同期同类住院患者98例,采用随机数字表法随机选择18例患者作为慢性阻塞性肺疾病组,其中男12例,女6例,年龄48～70岁,平均(56±7)岁。对照组14例,为来本院查体的健康成年人,其中男10例,女4例,年龄50～70岁,平均(59±8)岁。方法:用密度梯度离心法分离外周血中性粒细胞,利用流式细胞仪和原位末端标记技术观察外周血中中性粒细胞凋亡的动态变化。主要观察指标:各组外周血中性粒细胞凋亡率比较。结果:流式细胞分析显示,缓解期慢性阻塞性肺疾病患者凋亡早期中性粒细胞的比率为(8.5±1.3)%,明显低于正常对照组(12.5±1.8)%(t=6.25,P<0.01),急性加重期(5.1±0.6)

摘要：目的分析心内直视手术后急性呼吸窘迫综合症(ARDS)发生的危险因素,以提高心内直视手术后呼吸并发症的救治水平。方法采用自行设计的心脏外科数据库收集本院在1996年1月至2004年3 月期间ICU收治的52例ARDS患者的临床资料,并采用配比方法按1∶6选择同期手术、病种类似而术后未发生ARDS的心内直视手术的患者行二分类Logistic回归分析,评价各影响因素的作用大小。结果本组 ARDS患者死亡率为21．2％。经二分类Logistic回归分析结果显示:术前肾功能不全(OR=6．443)、肥胖 (OR=14．331)、术前存在合并疾病(OR=11．455)、围术期出现了意外情况(OR=7．988)、术后引流多 (OR=3．804)、术后输血量大(OR=9．763)等是心内直视手术后发生ARDS的危险因素。结论针对具有 ARDS高危因素的心内直视手术患者,采取积极的防范措施,对防止心内直视手术后发生ARDS及对早期诊断和处理具有重要的实际意义。

摘要：目的探索如何抑制嗜酸性粒细胞的趋化作用,选择β-趋化因子巨噬细胞炎性蛋白4(MIP4)的突变体(Met-MIP4)作为趋化因子受体3的拮抗剂,将Met-MIP4基因在原核细胞中进行非融合表达。方法设计MIP4基因的PCR引物并进行氨基酸突变,将MIP4N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸。以正常人肺cDNA文库为模板,PCR方法获取Met-MIP4基因。克隆入载体pUC19,测序验证序列已得到突变。将正确的基因插入到非融合表达载体pBV220中进行表达。结果PCR产物为220bp左右的片段,连接入pUC19质粒后测序验证获得正确突变。构建的pBV220非融合表达载体在大肠杆菌DH5-α中表达,经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳显示有大小约8×103的非融合蛋白表达。结论成功突变并克隆了β-趋化因子MIP4基因。Tricine-SDS-PAGE表明,非融合的Met-MIP4突变体已得到表达,为进一步研究其对哮喘的生物治疗奠定了基础。

摘要：目的探讨微小RNA(micro RNA,miRNA)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)发生风险的关系。方法通过生物信息学方法筛选出13个位于miRNA基因序列上的潜在功能性的SNPs位点。采用病例-对照研究设计,纳入新发NSCLC患者626例,对照为736例同期门诊体检人群。提取研究对象外周血细胞基因组DNA,采用SNPscan^(TM)对筛选的13个SNPs位点进行基因分型,多因素Logistic回归分析SNPs与肺癌发生风险的关联性和关联强度。结果发现3个SNPs,即rs62085660(位于miRNA AC145343.1)、rs11597888(位于miRNA AL391839.1)和rs16867808(位于miRNA AL021918.2)与NSCLC发生风险显著相关,但此种关联只限于特定的亚组人群。rs62085660(C/G)位点与肺鳞癌的发生风险相关(加性模型,校正OR=0.79,95%CI=0.62~1.00,P=0.049;显性模型,校正OR=0.72,95%CI=0.53~0.98,P=0.035)。rs11597888(G/A)和rs16867808(T/C)位点只在吸烟人群中与肺癌易感性相关(rs11597888:显性模型,校正OR=1.42,95%CI=1.03~1.96,P=0.033;rs16867808:加性模型,校正OR=0.58,95%CI=0.40~0.84,P=0.004,显性模型,校正OR=0.53,95%CI=0.35~0.81,P=0.004)。结论 rs62085660位点与肺鳞癌发生风险相关,rs11597888位点和rs16867808位点与吸烟相关性肺癌发生风险相关。

摘要：目的研究纳米载体Ac-αCD携带的Bcl-xl反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary arterial smooth muscle cells,RPASMCs)增殖和凋亡作用。方法设计合成5'端标记Cy3的Bcl-xlASON,由纳米载体Ac-αCD携带。实验分3组:纳米载体携带的Bcl-xl ASON组(ASON-NPs组)、单纯纳米载体组(NPs组)和空白对照组,分别使用纳米载体Ac-αCD携带的Bcl-xl ASON、纳米载体Ac-αCD和培养液处理RPASMCs 48 h,激光共聚焦显微镜观察RPASMCs对纳米载体携带的Bcl-xl ASON的摄取情况;RT-PCR、Western blot检测Bcl-xl的mRNA和蛋白表达;MTT检测处理后细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果激光共聚焦显微镜下可见ASON-NPs组细胞质内大量呈颗粒状均匀分布的红色荧光物质,空白对照组和NPs组细胞细胞质内未见红色荧光物质;ASON-NPs组处理的RPASMCs的Bcl-xl mRNA和蛋白表达显著低于空白对照组和NPs组(P<0.05);ASODN-NPs组、NPs组、空白对照组细胞抑制率分别为:(53.61±3.02)%、(6.30±1.90)%、(1.40±0.62)%,凋亡率分别为:(53.04±2.09)%、(10.98±2.03)%、(2.19±0.11)%、ASON-NPs组和NPs组细胞抑制率、凋亡率均显著高于空白对照组(P<0.01),ASON-NPs组均显著高于NPs组(P<0.01)。结论纳米载体Ac-αCD携带的Bcl-xl反义寡核苷酸能被RPASMCs有效摄取,从而抑制其增殖,促进凋亡。