摘要：目的制备针对人溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)的shRNA重组慢病毒,获得稳定低表达LAMP2A的MDA-MB-231乳腺癌细胞株,观察LAMP2A分子下调对乳腺癌细胞紫杉醇耐药性的影响。方法通过对LAMP2A的mRNA序列分析,设计了4条shRNA,通过基因重组技术构建pGLV-EGFP-shRNA慢病毒表达质粒,并测序鉴定。将构建的表达质粒和包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将构建的shRNA慢病毒表达载体感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株后,Western blot法检测LAMP2A表达,验证蛋白表达抑制效果。采用1 nmol/L、10 nmol/L、100nmol/L的紫杉醇处理LAMP2A低表达乳腺癌细胞株后,用MTT法观察LAMP2A低表达组和对照组之间增殖效率的差异。结果测序结果显示重组慢病毒质粒构建正确,病毒滴度达2×108TU/mL。乳腺癌稳定细胞株中LAMP2A蛋白表达量显著降低。在10 nmol/L、100 nmol/L紫杉醇处理后,LAMP2A低表达乳腺癌细胞株对紫杉醇耐药性明显降低(P<0.05)。结论成功构建了人的LAMP2A基因shRNA慢病毒载体,获得了稳定低表达LAMP2A的乳腺癌细胞株,证实LAMP2A下调能够降低乳腺癌细胞株对紫杉醇的耐药性。

摘要：目的构建IRF-4结合蛋白(IBP)基因RNA干扰(RNAi)的真核表达载体,观察其对MDA-MB-231乳腺癌细胞内IBP基因表达及细胞增殖和侵袭力的影响。方法以IBP为靶基因,以pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR质粒为载体,设计构建4对重组体,并进行DNA测序鉴定。重组载体转染MDA-MB-231细胞后,选择转染效果最好的1对重组体建立稳定转染的细胞株,经RT-PCR和Westernblot检测重组表达质粒对IBPmRNA和蛋白表达的抑制效果;MTT法检测对各组细胞生长的影响;细胞体外侵袭实验测定对侵袭力的影响。结果重组体测序结果与目的序列完全一致;重组体转染MDA-MB-231细胞后IBP的mRNA和蛋白表达降低约70%;IBP表达下调后乳腺癌细胞增殖减缓(P<0.05);同时体外侵袭实验显示转染后乳腺癌发生迁移细胞数明显低于未转染组和空质粒对照组[分别为(25±7)、(67±6)、(68±5),P<0.05]。结论下调IBP能有效降低乳腺癌细胞的增殖和侵袭力。