摘要：目的设计构建新型内毒素结合肽突变体(mutant of endotoxin binding peptide,mEBP),并研究其体内外拮抗内毒素效应。方法采用F-moc固相合成法获得内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)及其突变体mEBP;CCK-8法检测mEBP对RAW264.7细胞增殖的影响;ELISA法检测mEBP对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6的影响;Western blot法检测mEBP对LPS诱导的RAW264.7细胞表达p-p38 MAPK的影响;中性红法测定mEBP对LPS诱导的RAW264.7细胞吞饮功能的影响。复制烧伤合并内毒素血症小鼠模型;检测mEBP对建模后6 h小鼠血浆中TNF-α、ALT和AST浓度的影响;检测mEBP对模型小鼠48 h生存率的影响。结果 mEBP无可见的细胞毒性;mEBP可降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6(P<0.05);抑制p-p38 MAPK信号通路的激活;抑制RAW264.7细胞的吞饮功能(P<0.01);mEBP预处理可明显降低烧伤合并内毒素血症模型小鼠血浆中的TNF-α、ALT和AST浓度(P<0.05),提高模型小鼠48h生存率。结论 mEBP和EBP均具有明显的拮抗内毒素活性,其中mEBP拮抗活性更强。

摘要：目的将改良人源杀菌肽LL-37(rLL-37)用两种方法构建,并分别在原核细胞中融合表达,以寻找较好的制备方法。方法①将编码rLL-37基因序列放入载体pET-28a(+),构建表达质粒pET-28a(+)-rLL-37,并于工程菌BL21(DE3)中融合表达、纯化;②将编码rLL-37基因序列中的部分原核细菌稀有密码子替换为原核细菌偏爱密码子,并在其N端加入一段编码带负电荷的承载蛋白(carrierproteinmolecule,CPM)基因序列,构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37,并于工程菌BL21Star(DE3)中融合表达、纯化。对比上述2种方法rLL-37的制备率,并初步研究其抗菌性。结果通过Touch-DownPCR法成功获得rLL-37多肽的DNA序列,质粒pET-28a(+)-rLL-37于杆菌BL21(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的20%,并成功由强阳离子交换柱芯Macro-PrepHighS纯化;设计了一段含28个氨基酸残基的CPM(pHi2.7、pH7.4时电荷为-6.0),成功构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37,并于杆菌BL21star(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的35%,并被TALON亲和柱芯有效纯化。经抑菌圈实验证明两种方法所获得的rLL-37多肽对G+、G-菌都具有较好的杀菌力。结论rLL-37在原核细胞中的高效表达,为深入研究rLL-37的杀菌活性奠定了基础。

摘要：目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。

摘要：目的利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.结果将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.

摘要：目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变。并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定。结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合。结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达。

摘要：高密度组织微阵列(high-density tissue microarrays,TMAs)又称组织芯片(tissue chips),是近几年发展起来的新技术,它能将数十个、数百个乃至上千个组织标本按预先的设计整齐地排列在某一载体上而成的微缩组织切片,可使科研人员同时对几百甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段的组织样本进行研究.组织芯片技术可以与DNA、RNA、蛋白质、抗体等技术相结合,以及与传统的病理学技术、组织化学、免疫组化及技术相结合,在基因、基因转录和表达产物生物学功能三个水平上进行研究.因此,组织芯片是基因芯片(gene chip)和蛋白质芯片(protein chip)的技术补充,它们一起构成了生物芯片(biochips)系列,被誉为医学、生物学领域的一次革命.该技术问世后主要应用在肿瘤学的研究,在胶质瘤研究领域的应用也引起了人们的重视.

摘要：目的　探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)、一氧化氮 (NO)在烧伤合并内毒素血症早期肾脏损害中的作用及其意义。　方法　以大鼠体表烧伤Ⅲ度 2 0 %TBSA合并小剂量内毒素 (1mg/kg体重 )腹腔注射造成多脏器损害模型 ,按设计分组并在致伤后不同时相点进行肾脏病理形态学观察、TNFα和NO血清浓度测定、TNFαmRNA原位杂交和iNOS免疫组化染色。　结果　烧伤后注射内毒素组诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)的表达和NO的合成以及TNFαmRNA的表达和TNFα的血浆水平均显著高于和早于单纯烧伤组和单纯注射内毒素组。　结论　烧伤合并内毒素血症时肾组织中NO和TNFα的水平显著升高 。

摘要：目的　筛选经辐射诱导后小鼠肠上皮细胞的差异或特异表达基因。方法　通过基因库检索和计算机分析 ,设计出较通用的 5’端武断引物在基因库中其呈现几率要高出数倍到数十倍的 4条 5′端高同源mRNA差示引物 ,应用DDRT PCR ,测序凝胶电泳 ,放射自显影 ,分子杂交等方法 ,分析并筛选小鼠受 12Gyγ射线全身照射后 3h(R1组 )和 96h(R2组 )肠上皮细胞差异或特异表达基因。结果　 5′端高同源性引物mRNA差异结果显示 ,与正常比较 ,小鼠全身 12Gy照射后不同时相的肠上皮细胞基因表达存在差异 ,从近 80 0 0条PCR扩增产物中 ,比较筛选出 12个差异表达基因片段。RNA blot杂交对 11个辐射损伤情况下差异表达基因片段进行了鉴定。R1S1和R1S2差异基因片段在辐射损伤后 3h的肠上皮细胞中呈特异性表达 ;R2S2和R2S5基因片段在辐射损伤后 96h的肠上皮细胞中呈特异性表达 ;R2S1、R2S6和R2S8基因片段是假阳性差异表达基因片段 ;而R2S1、R2S4及R2S8用RNA blot法检测不到表达。序列分析结果显示R1S1和R2S2在基因库中未见高同源的基因序列 ,与R1S1同源性最高 (60 0 0 % )的是一个源于大鼠输卵管特异性糖蛋白基因 ,R2S5与一种小鼠肌细胞钙离子信号传导分子有 67 2 1%的同源性 ;R2S2高度同源于鼠源性肿瘤诱导蛋白p3 2 (91 5 2 % )

摘要：目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NHLBP抗体。方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NHLBP高度结合的单链抗体片段。结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340bp和325bp,经连接后约为750bp。经过体外表达得到了约27000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NHLBP高度结合的抗体。结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NHLBP高度结合的抗体。

摘要：背景:如何减轻甚至消除脂多糖(LPS)引起的全身炎症反应是目前研究的热点;库普佛细胞(KC)的激活与LPS的这种作用密切相关,但关于其具体的机制尚有待于进一步研究。目的:探讨LPS对KCCD14表达的影响及CD14在LPS激活KC中的意义。设计:完全随机前后对照研究。地点和对象:在第三军医大学西南医院病理学研究所完成。大鼠KC来源于Wistar大鼠,购自第三军医大学实验动物中心。干预:在分离培养大鼠KC的基础上,作者应用LPS直接或LPS刺激KC后产生的介质刺激新培养的KC,或在血清存在的情况下加入抗CD14单抗或在无血清的情况下单独加入LPS等措施刺激KC细胞。主要观察指标:各种条件下CD14mRNA的表达及其蛋白合成的变化、培养KC中上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和一氧化氮浓度。结果:①CD14mRNA表达及其蛋白合成在正常KC中极弱,分别为0.035和19.91±2.89,浓度为10mg/L的LPS分别为0.73和676.79±24.95,其量与LPS浓度呈剂量依赖性相关。浓度为10μg/L的LPS刺激后KC中CD14mRNA表达及其蛋白合成在30min即明显增强,分别为0.56和548.86±40.43,至6h达高峰(0.54和673.91±35.08)。②在血清存在时加入抗CD14单抗或在无血清时单独加入LPS,可明显降低KCTNF-α,IL-6和一氧化氮的释放。而后者如果同时加入LBP,则可?