摘要：背景:胶质瘤的发生、发展不仅涉及细胞周期调控基因,也涉及到细胞侵袭、转移和细胞凋亡的调节基因。目的:用基因芯片技术分析不同分化程度的胶质瘤细胞增殖和凋亡相关的差异表达基因,为进一步研究胶质瘤细胞的增殖和凋亡机制奠定基础。设计:开放性实验。单位:解放军第三军医大学,西南医院病理学研究所,基础医学部神经生物学教研室,新桥医院药剂科。材料:人脑恶性胶质瘤细胞系CHG-5(WHO分级为Ⅱ级)由本实验室建立并保存培养;SHG-44(WHO分级为Ⅳ级),由苏州医学院附属二院脑肿瘤研究室提供,小牛血清由杭州四季青生物材料研究所生产并提供。实验中还采用了RPMI-1640培养基(Gibco)、Trizol试剂盒(Gibco-BRL)、RNAsecureTM溶液(Ambion,Austin,Texas)、光度适应计(Eppendorf,Hamburg,Germany)。基因芯片含9,984个人类cDNA片段,由香港城市大学准备和提供(UniGEMV2cloneset已知的基因和ESTs购自Incyte公司),SuperscriptⅡ反转录酶由Gibco-BRL公司提供,荧光染料Cy3&Cy5为AmershamPharmacia公司产品。方法:实验于2001/2003在重庆第三军医大学和香港城市大学完成。用Trizol试剂盒抽提总RNA,用SuperscriptⅡ反转录酶进行反转录聚合酶链反应,并用荧光染料Cy3&Cy5标记cDNA产物,然后进行芯片杂交,检测人胶质瘤细胞系CHG-5和SHG-44瘤细胞基因表达的差异,特别是与细胞增殖和凋亡相关基因表达的差异,并用Northernblot杂交来验证芯片结果。主要观察指标:不同分化程度的人胶质瘤细胞基因表达的差异;Northern杂交结果与相应基因芯片结果的比较。结果:①与CHG-5相比,SHG-44细胞中检测到了有120个基因表达明显上调和22个基因表达明显下调,这些差异表达基因的种类很多,其中凋亡类相关基因共6个,上调基因有3个,下调基因3个;细胞周期与增殖类相关基因共12个,上调基因有5个,下调基因7个。②芯片结果进一步得到Northernblot杂交结果的支持。结论:初步揭示了胶质瘤进展的差异表达基因,特别是与细胞增殖和凋亡相关的差异表达基因。

摘要：背景:组织毛细血管增多,可缩短氧从毛细血管向组织细胞弥散的距离,改善组织供氧。但组织毛细血管密度与组织的代谢水平密切相关,单纯缺氧能否引起骨骼肌毛细血管密度增加尚有争议。目的:观察不同缺氧时间大鼠骨骼肌毛细血管密度和血流供应的变化规律。设计:非随机对照实验。对动物缺氧前体质量加以选择,使各组动物的体质量在缺氧末期基本接近。地点和对象:实验地点:第三军医大学病理生理学与高原生理学教研室。清洁级纯种健康Wistar大鼠64只,雌雄各半,分为4组:对照组、缺氧5d组、缺氧15d组和缺氧30d组。干预:缺氧5d组、15d组和30d组大鼠在模拟海拔5000m的减压舱中分别连续减压缺氧5,15和30d后(23h/d),对照组大鼠在舱外饲养。用肌球蛋白ATP酶(mATPase)组织化学方法显示骨骼肌Ⅰ,Ⅱ型纤维和毛细血管并进行图像分析,测定骨骼肌纤维横断面积和毛细血管密度以及单位面积内毛细血管数与肌纤维数的比值;用放射性微球法测定骨骼肌血流量和血管阻力。主要观察指标:①各组大鼠血球压积和骨骼肌血流量、血管阻力的变化。②大鼠腓肠肌Ⅰ,Ⅱ型纤维横断面积。③各组大鼠骨骼肌毛细血管密度和单位面积内毛细血管数与肌纤维数的比值。结果:缺氧5d组大鼠与对照组相比。

摘要：目的:构建VEGF-C基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法:以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果:经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。

摘要：目的构建新型人内毒素结合肽（a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues，EBP25）及其突变体（mutant of EBP25，mEBP25）的原核表达重组质粒，并在大肠埃希菌中诱导表达。方法采用PCR法，扩增EBP25基因，构建pET-30-EBP25.融合表达载体并转化Ecoli DH5α扩增。重组质粒经酶切和测序鉴定后，应用快速定点突变法将EBP25第2位缬氨酸和第5位谷氨酰胺所对应碱基均替换成赖氨酸所对应的碱基，突变后重组质粒再经测序鉴定后，将二者转化至*** BL21（DE3）PlysS后经IPTG诱导表达，表达产物采用Western印迹进行鉴定后，用His—Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果两次测序结果显示人EBP25，和mEBP25重组序列和理论设计序列完全一致后，经IPTG诱导表达获得目的融合蛋白，通过SDS—PAGE电泳、Western印迹证实蛋白表达的特异性，并对蛋白进行纯化，获得EBP25和mEBP25融合蛋白。结论构建、表达纯化了EBP25和mEBP25融合蛋白，为进一步研究其中和内毒素／月旨多糖活性奠定了基础。