摘要：对20余种细菌16SrDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)特异性引物。提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16SrDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr。将梯度稀释的pMDT-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线。以SYBRGreenI荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PADNA样品进行FQ-PCR检测。同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性。结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16SrDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言,以16SrDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景。

摘要：筛选117条炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）特异序列，经双重特异性验证后得到19条理想的特异序列（genomic signatures），其中6条符合设计TaqMan探针建立实时定量PCR的要求，根据常规PCR检测结果选择其中CO4片段与炭疽芽胞杆菌毒性质粒pX01、pX02上的pagA、capB基因建立实时定量PCR检测体系。经试验证实这一体系检测灵敏度达到每PCR反应10～100个拷贝。利用12种相关菌株评价后获得100％特异性，对10份模拟污染标本和20份对照标本检测，所有污染标本均被检出，所有对照标本均为阴性。此方法特异、灵敏、高效，在炭疽芽胞杆菌感染的诊断和环境污染的检测等领域有潜在的应用前景。

摘要：研究丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)高变区1(Hypervariable region 1,HVR1)抗原表位的交叉反应性,获取高反应性的抗原表位。设计并合成5种HVR1模拟表位基因,构建编码HVR1模拟表位的表达载体,表达并纯化表位蛋白。ELISA法检测表位蛋白与35份HCV抗体阳性血清的交叉反应性。包装HCV假病毒(HCVpseudotype particles,HCVpp),评价表位蛋白免疫BALB/c鼠血清在假病毒感染Huh7.5细胞中的作用。结果表明,表达纯化的5种表位蛋白(P1、P2、P5、P6、P8)均可与HCV抗体阳性血清反应,阳性反应率分别为54.3%(P1)、62.9%(P2)、80%(P5)、68.6%(P6)、54.3%(P8)。表位蛋白P6、P8免疫BALB/c鼠血清对HCV假病毒感染Huh7.5细胞具明显的抑制作用。结果提示,选取的HVR1模拟表位在HCV感染免疫与疫苗研制中可能具有潜在的价值。

摘要：目的探讨快速筛选血液及血液制品中细菌污染的方法。方法对20余种常见致病性细菌的16SrDNAs进行多序列比对,设计扩增细菌16SrDNAs基因的荧光定量PCR(FQ-PCR)通用引物。以12种致病菌、2种真菌、1种支原体、1种病毒和人基因组DNA为模板,验证通用引物检测细菌的特异性。通用引物扩增金黄色葡萄球菌16SrDNA靶片段,构建标准质粒pMDT-Bfr,并建立FQ-PCR定量标准曲线。分别以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作为革兰阳性和革兰阴性细菌代表菌,以其不同浓度的DNA为模板进行FQ-PCR反应,检验该方法的敏感性。抽提梯度稀释的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌模拟血液细菌污染标本的总DNA作为FQ-PCR反应模板,检验基于16SrDNAs的FQ-PCR作为血液细菌污染检测方法的敏感性。结果设计的FQ-PCR通用引物有较高的特异性,仅能检测出细菌的16SrDNAs;用该方法检测革兰阳性和革兰阴性菌,对于浓度在103拷贝/μl以上的16SrDNAs基因都可以准确定量;以该方法检测血液细菌污染模拟标本,灵敏度可达到105CFU/ml。结论初步建立了以16SrDNAs作为FQ-PCR靶基因快速检测血液细菌污染的方法。该方法特异性强、灵敏度高、成本低廉,具有很好的研究价值与应用前景。