摘要：目的探索经载体介导的RNA干扰法建立人NADH-细胞色素b5还原酶（EC1．6．2．2，NADH-cytochrome b5 reductase，65R）缺陷细胞系的可行性。方法设计并构建b5R的两种小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）表达载体，脂质体转染法瞬时转染BEL-7402细胞，半定量逆转录-PCR分析重组载体的干扰效应；G418筛选两种表达载体稳定转染的BEL-7402细胞，并通过稳定转染的细胞克隆在b5R mRNA水平，酶活性，酶含量等方面干扰效果的鉴定，获得b5R缺陷的细胞克隆；噻唑蓝法测定b5R缺陷细胞的生长曲线。结果获得两个靶向b5R基因的siRNA重组表达载体pSib5R-1和pSib5R-2，其中pSig5R-2瞬时转染对BEL-7402细胞b5RmRNA的抑制率达68．3％。获得18个稳定转染的细胞克隆，pSib5R-2转染的克隆中有两个克隆b5RmRNA抑制率达48．2％和56．2％，酶活性抑制率为54．6％和63．5％，酶含量也有明显降低。b5R酶缺陷没有改变细胞的生长速度。结论b5R基因的表达可被载体介导的RNA干扰有效抑制，成功建立了b5R缺陷的细胞表型，为进一步研究b5R基因的功能以及探讨Ⅱ型隐性先天性高缺血红蛋白症的发生机制提供了实验依据和材料。

摘要：目的探索经载体介导的RNA干扰抑制人NADH-细胞色素b5还原酶(b5R)基因表达的可行性。方法应用网络在线软件设计并合成两条针对b5R mRNA的RNA干扰的DNA模板片段,分别将其克隆至经过改建、带有neo基因的pSilencer1.0-U6载体上,构建成siRNA真核表达载体;脂质体转染法将上述重组质粒转入人肺成纤维细胞和BEL-7402肝癌细胞株。通过半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR分析,检测所构建的重组siRNA真核表达载体对b5R基因表达的干扰效应。结果获得两个能在细胞内生成靶向b5R基因siRNA的重组载体pSib5R-1和pSib5R-2;其中pSib5R-2对成纤维细胞b5RmRNA的抑制率达81·7%,对BEL-7402细胞b5RmRNA的抑制率达60%。结论两种细胞b5R基因的表达均可被载体介导的RNA干扰有效抑制;成功构建了针对b5R基因的siRNA表达载体,为建立稳定表达siRNA的、b5R酶缺陷的细胞模型提供了实验基础。