摘要：目的:克隆人ALK-1基因并构建其真核表达载体.方法:设计ALK-1特异性引物,提取人胚胎肺组织总RNA,用RT-PCR方法获取人ALK-1 cDNA.将ALK-1 cDNA克隆至pcDNA3.1/myc-His(-),双酶切鉴定并测序后,转染HEK293细胞.用Western Blot检测目的蛋白的表达.结果:成功获得人ALK-1全长cDNA,双酶切鉴定证实成功构建pcDNA3.1(-)/ALK-1.测序结果表明ALK-1全长cDNA与GeneBank中ALK-1序列完全一致.转染HEK293细胞后,可检测出Mr约为62×103的目的蛋白.结论:获得了ALK-1全长cDNA并成功构建了ALK-1真核表达载体,证实pcDNA3.1(-)/ALK-1转染HEK293细胞后可表达ALK-1蛋白,为深入研究ALK-1介导的TGFβ信号转导通路在创面愈合以及瘢痕疙瘩发生,发展中的作用奠定了基础.

摘要：目的:使用骨钙素启动子构建骨组织特异性小发卡状RNA表达载体。方法:实验于2003-11/2004-09在解放军第四军医大学全军骨科研究所和全军整形外科中心完成。以HEK293细胞基因组为模板,利用聚合酶链反应扩增人骨钙素启动子。将骨钙素启动子、针对虫荧光素酶的小发卡状RNA编码序列和多腺苷酸信号依次克隆至pGL3-control载体的相应酶切位点,经双酶切鉴定和DNA测序证实后命名为pGL3-OCP-shLuc。将pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control分别共转染人胚胎肾细胞HEK293和人骨肉瘤细胞MG-63,48h后测定虫荧光素酶活性,计算相对活性。结果:使用特异性引物成功扩增出长度为830bp的人骨钙素启动子聚合酶链反应产物。DNA测序结果证实pGL3-OCP-shLuc中的小发卡状RNA表达框与设计完全一致。pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control共转染HEK293细胞后,虫荧光素酶相对活性与对照组相比没有明显差异,而共转染MG-63细胞后虫荧光素酶相对活性显著降低,剔出效率约为69.8%。结论:成功使用人骨钙素启动子构建了小发卡状RNA表达载体,并实现了骨组织特异性RNA干扰,为将RNA干扰技术引入骨肉瘤基因治疗领域奠定了基础。